金屬螯合層析(metalchelatechromatography)分離純化超氧化物歧

[原理]
金屬螯合層析是利用固定相偶聯的配基——亞氨基二乙酸(IDA)及金屬離子發生螯合作用，該金屬離子又與蛋白分子中的某些含有巰基或咪唑基的氨基酸結合。
金屬螯合層析主要分為3個階段：第一階段是螯合介質與二價金屬離子作用生成金屬螯合介質；第二階段是在一定的條件下金屬螯合介質與被分離蛋白質分子形成金屬螯合復合物；第三階段是從金屬螯合介質上將被分離物質解吸下來。
本實驗采用亞氨基二乙酸(IDA)以二納鹽形式與環氧化的瓊脂糖-6B結合，再在偏堿性的條件下與二價金屬銅離子發生可逆性螯合，二價金屬銅離子又與含有咪唑基的超氧化物歧化酶發生可逆性的螯合吸附。金屬離子在螯合介質與被分離分子之間起著橋梁作用，金屬離子的一端與螯合介質連接，另一端與被分離組分結合。這兩種結合方式都是可逆的，在一定條件下洗脫被分離組分。

[試劑和器材]
1、試劑
（1）瓊脂糖
（2）亞氨基二乙酸（IDA）
（3）環氧氯丙烷
（4）三羥甲基氨基甲烷（Tris）
（5）氫氧化鈉
（6）氯化鈉
（7）硼氫化鈉
（8）pH10.0、2mol/LNa2CO3 -NaHCO3緩沖液
（9）pH7.2、20mmol/L磷酸緩沖液

2、器材
（1）層析柱
（2）紫外分光光度計
（3）部分收集器
（4）沸水浴
（5）金屬網篩

[方法和步驟]
1、 IDA-瓊脂糖6B的制備
稱取瓊脂糖2g，加入蒸餾水30mL，沸水浴充分溶解，待冷卻結塊后，過20~30目篩，稱重，每克濕重加入 1mol/L NaOH（含0.2%NaBH4）1mL，然后在30℃水浴中攪拌下加入1/10倍上述氫氧化鈉體積的環氧氯丙烷。水浴溫度緩慢升至 60℃，保溫繼續反應2h，趁熱過濾并用預熱的蒸餾水洗滌至近中性。
10g上述凝膠中加入50mL含2g IDA的pH10.0、 2mol/LNa2CO3-NaHCO3緩沖液，于60~65℃水浴中攪拌24h，其間分次加入20 mL含3g IDA的碳酸鹽緩沖液。反應產物用2L水、10%乙酸0.5L、2L水依次洗滌。

2、柱制備
按常規將IDA-瓊脂糖6B裝柱（1.5cm×20cm），用10mmol/LCuSO4流過層析柱，螯合銅離子，制備成親和層析柱。

3、 SOD親和層析
親和層析柱用20mmol/L磷酸緩沖液（pH7.2，含0.5mol/LNaCl）平衡，含SOD 的粗制品上柱后，依次用 20mmol/L磷酸緩沖液（pH7.2，含0.5mol/LNaCl）、20mmol/L磷酸緩沖液（pH6.0，含0.8mol/LNaCl）、 20mmol/L磷酸緩沖液[pH7.8，含0.5mol/L(NH4)2SO4] 洗脫。收集SOD活性峰，測定酶活性和蛋白質濃度。

[結果與計算]
計算金屬螯合層析前后樣品和收集峰的酶比活、純化倍數、酶活性回收率和蛋白質回收率。