金標準qPCR仍無法有效檢查BCRABL，怎么辦？

　　慢性粒細胞白血病（Chronic Myelocytic Leukemia，下文簡稱 CML），是一種影響血液及骨髓的惡性腫瘤，抑制骨髓正常造血，通過血液擴散全身，導致病人出現貧血、容易出血、感染以及器官浸潤等病癥。

　　監測 CML 疾病負荷的常規方法有三種：

　　血液學反應（HR）-評估血細胞計數和分化

　　細胞遺傳學反應（CyR）-骨髓細胞中期染色體帶型分析

　　分子學反應（MR） -BCR-ABL 轉錄本水平相對于對照基因的檢測

　　目前，BCR-ABL 水平檢測因其結果簡單、準確且意義明確而被積極采用，且相對于細胞遺傳學水平來說檢測 BCR-ABL 水平會更加簡便，僅需進行血液檢測，無需骨髓活檢。國際臨床試驗結論來自 BCR-ABL IS 數據，CML 治療指南的制定也是基于這一指標。此外，BCR-ABL 融合基因檢測對于前期 CML 疾病輔助診斷及后續靶向用藥指導及殘留病監測方面亦具有臨床意義。

　　那么為什么要檢測 BCR-ABL 水平呢？

　　研究人員發現 CML 患者體內 22 號染色體更短，后續研究指出是因為這類患者體內 9 號染色體上的 ABL 基因會與 22 號染色體上的 BCR 發生里交換，形成 BCR-ABL 融合基因，該基因可轉錄出一個 8.5kb 的異常 mRNA，最終翻譯成 210kD 大小的蛋白質——P210，P210 具有較強的酪氨酸蛋白激酶活性，可通過多種信號轉導途徑來活化原癌基因和某些細胞因子，導致細胞的惡性轉化。

　　Ps: >95% CML 病例為 P210「b3a2/b2a2」（或稱「e14a2/e13a2」，下圖紅框標記）型。

　　國際上如何利用 BCR-ABL 水平指導臨床？

　　%IS：International Scale percent ratio

　　CF：轉換因子（將一個特定的實驗室中得到的 BCR-ABL 值與從一個中心參考實驗室特定樣本得到的一組 BCR-ABL 值進行比較，CF 值需要定期進行重新評估）

　　MR：Molecular log Reduction level

　　即通過檢測 BCR-ABL 及 ABL 水平結合每個實驗室的 CF 值來計算 %IS 值，然后通過 %IS 值反應 MR 水平，最后借此指導臨床治療，調整治療方案。下表中 MMR 意為主要分子學反應，是目前 CML 患者的重要治療目標。

　　如何檢測 BCR-ABL 水平？

　　提示：目前臨床上檢查 BCR-ABL 融合基因的金標準是 qPCR 技術，但由于 qPCR 技術的定量檢測依賴標準的參考物質。此外 qPCR 技術的技術局限導致檢測靈敏度不夠高，對微小殘留病無法實現有效監測。

　　那么有沒有一種技術/一款試劑盒能夠高靈敏度地對 BCR-ABL 融合基因進行準確定量呢？答案是有的。

　　眾所周知，Bio-Rad QX200 微滴式數字 PCR 技術（下文簡稱「ddPCR」）以分子計數的方式實現對靶標核酸分子的絕對定量。相對熒光定量 PCR 技術來說，ddPCR 技術不依賴于標準曲線，且靈敏度、重復性和準確性有很大提高。在癌癥分子標志物發現、病毒載量分析、傳染病研究、基因組結構變異及 NGS 文庫定量方面都得到了廣泛應用。

　　QXDx BCR-ABL %IS 試劑盒是 Bio-Rad 推出的基于 QX100/200 微滴式數字 PCR 平臺的 BCR-ABL 融合基因定量檢測試劑盒，靈敏度可達 MR4.7 或 MR5.0 水平。更值得一提的是該款試劑盒在 2017 年 12 月份獲得了 CE-IVD 認證，這也是第一個在歐洲獲批的、針對血液樣本的BCR-ABL 定量檢測試劑盒，目前也在申報美國 FDA 認證。

　　如何利用該試劑盒進行 BCR-ABL %IS 水平檢測呢？

　　該試劑盒中除了反轉錄需要的試劑、引物、ddPCR 過程中需要引物探針外，還內置一系列 Control 及 Calibration 樣本，確保檢測結果的有效性、準確性。

　　Controls：

　　高水平陽性對照  -MR0.3-MR1.0 (10%-50%IS)

　　低水平陽性對照  -MR3.0-MR5.0 (0.001-0.1%IS)

　　陰性對照  -< MR5.3 (0.0007%IS)

　　Calibrations：~0.1%IS 和 ~10%IS

　　該試劑盒與 qPCR 結果一致性，靈敏度、特異性檢測結果如下：

　　參考文獻：

　　[1] Jennings L.J, George D, Czech J, Yu M, Joseph L. Detection and Quantification of BCR-ABL1 Fusion Transcripts by Droplet Digital PCR. The Journal of Molecular Diagnostics. 2014 Mar；16(2):174-9.

　　[2] Cross N.C, White H.E etc. Development and evaluation of a secondary reference panel for BCR-ABL1 quantification on the International Scale. Leukemia. 2016 Sep；30(9):1844-52.

　　[3] Zagaria A, Anelli L, Coccaro N etc. BCR-ABL1 e6a2 transcript in chronic myeloid leukemia: biological features and molecular monitoring by droplet digital PCR. Virchows Arch. 2015 Sep；467(3):357-63

　　[4] Tang Y, Wei X, Chen J, Du Y, Chu H etc. Absolute quantification of BCR-ABL1 fusion transcripts in pediatric chronic myeloid leukemia. Leuk Lymphoma. 2016 Sep；57(9):2216-8.