金黃色葡萄球菌、沙門氏菌快速檢測方法

在發達國家以及發展中國家，食源性致病菌引發的疾病已經成為嚴重威脅公眾健康的重要因素^[1,2]。金黃色葡萄球菌（StaphylococcusAureus）是引發多種類型感染和食物中毒的病原菌，由此引發的食物中毒發生頻率很高^[3]。沙門氏菌是最常見的食源性致病菌，也是食源性致病菌中研究最活躍的細菌^[4]。沙門氏菌大多數由食物傳播，少數可通過水介質傳播，可引起多種腸道性疾病及食物中毒^[5]，是世界上分布最廣泛的致病菌之一。

傳統的檢測方法檢測食品中的致病菌存在周期長、步驟繁瑣等缺點，如何快速準確地檢測食品中的致病菌已經成為當前的研究熱點^[6]，快速而準確的檢測食源性致病菌的方法變得越來越重要^[7,8]。

實時熒光定量PCR融匯了PCR技術的核酸高效擴增、探針技術的高特異性以及熒光技術的高敏感性^[9]，在食源性致病菌的檢測上已經得到了廣泛的應用。

本研究對使用實時定量PCR原理的金黃色葡萄球菌/沙門氏菌核酸檢測試劑盒進行了多方面的評價，為食品安全檢測中金黃色葡萄球菌/沙門氏菌的檢測提供了一種快速準確的檢測手段。

實驗材料

樣本

奶粉、巴氏奶、純奶、發酵乳。

菌株

金黃色葡萄球菌陽性菌株：

ATCC27217、ATCC26113、ATCC25923、ATCC29213、ATCC6071、CMCC（B）26003、ATCC6538、ATCC26112、ATCC33591、ATCC43300、FSCC（I）223189等標準菌株及金黃色葡萄球菌分離株共1177株；

金黃色葡萄球菌干擾菌株：

CMCC26069表皮葡萄球菌、ATCC29544阪崎腸桿菌、ATCC25922大腸桿菌、ATCC29212糞腸球菌、ATCC8090弗氏檸檬酸桿菌、CMCC51572福氏志賀氏菌、ATCC10792蘇云金芽孢桿菌、CMCC49027變形桿菌、CMCC52202小腸結腸炎耶爾森氏菌、ATCC25922大腸埃希氏菌、ATCC19115單增李斯特菌、CMCC51252痢疾志賀氏菌、CMCC63301蠟樣芽胞桿菌、ATCC27853銅綠假單胞菌、ATCC11774枯草芽孢桿菌、ATCC33560空腸彎曲菌、CMCC50333沙門氏菌等非金黃色葡萄球菌標準菌株17株；

沙門氏菌陽性菌株：

CICC21482、CMCC50333、CMCC50220、ATCC14028、CMCC(B)50115、CMCC(B)50071、CMCC(B)50335、CMCC(B)50093、CMCC(B)50094、CICC21480、CICC21488、CICC21489、CICC21497、CICC21498、CICC21586、ATCC7001、ATCC35640、ATCC9842、ATCC13314、ATCC9150、ATCC29934、CMCC50041等標準菌株及沙門氏菌分離株共643株；

沙門氏菌干擾菌株：

CMCC26069表皮葡萄球菌、ATCC29544阪崎腸桿菌、ATCC25922大腸桿菌、ATCC29212糞腸球菌、ATCC8090弗氏檸檬酸桿菌、CMCC51572福氏志賀氏菌、ATCC10792蘇云金芽孢桿菌、CMCC49027變形桿菌、CMCC52202小腸結腸炎耶爾森氏菌、ATCC25922大腸埃希氏菌、ATCC19115單增李斯特菌、CMCC51252痢疾志賀氏菌、CMCC63301蠟樣芽胞桿菌、ATCC27853銅綠假單胞菌、ATCC11774枯草芽孢桿菌、ATCC33560空腸彎曲菌、ATCC27217金黃色葡萄球菌等非沙門氏菌標準菌株17株。

主要試劑

金黃色葡萄球菌核酸檢測試劑盒（PCR-探針法）LR70501、沙門氏菌核酸檢測試劑盒（PCR-探針法）LR70601。

7.5%NaCl肉湯、BPW、BP平板、血平板、血漿凝固酶試劑、SC、TTB、XLD平板、BS平板、TSI、賴氨酸、NA、靛基質、尿素、氰化鉀等培養基。

主要儀器

實時熒光PCR儀：雅睿MA-6000P、伯樂CFX96。恒溫培養箱、離心機（2mL）、掌式離心機（0.2mL8聯管）、金屬浴、渦旋混合器、移液器（10、100、1000μL）及吸頭、離心管（2mL）、PCR反應管（0.2mL）等。

實驗方法

識別性及特異性檢測

用金黃色葡萄球菌/沙門氏菌核酸檢測試劑盒（PCR-探針法）對金黃色葡萄球菌/沙門氏菌陽性菌株（標準株及分離株）及其干擾菌株進行檢測并記錄檢測結果。

靈敏度檢測

取金黃色葡萄球菌/沙門氏菌標準菌株增菌液，分別稀釋到101、102、103、104CFU/mL，并進行核酸提取及PCR檢測，每株標準株每個濃度進行10次實驗，10次檢測都是陽性的最低濃度即為金黃色葡萄球菌/沙門氏菌核酸檢測試劑盒（PCR探針法）對該菌株的檢測靈敏度^[10]。

取樣品（奶粉、巴氏奶、純牛奶以及發酵乳）25g（mL），加入225mL、7.5%NaCl肉湯/BPW；取金黃色葡萄球菌ATCC27217/沙門氏菌CICC21498標準菌株增菌液添加到稀釋好的樣品中，使終濃度分別為101、102、103、104CFU/mL，并取1mL進行核酸提取及PCR檢測；每種樣品每個濃度進行10次實驗，10次檢測都是陽性的最低濃度即為金黃色葡萄球菌/沙門氏菌核酸檢測試劑盒（PCR-探針法）對樣品（奶粉、巴氏奶、純牛奶以及發酵乳）中金黃色葡萄球菌/沙門氏菌的檢測靈敏度。

增菌濃度及驗證實驗

取樣品（陰性發酵乳）25g，加入225mL，7.5%NaCl肉湯/BPW，添加金黃色葡萄球菌ATCC27217/沙門氏菌CICC21498約2CFU，重復30次，37℃增菌18h，對增菌后的樣本進行金黃色葡萄球菌/沙門氏菌的計數并按照國標進行進一步的驗證，記錄陽性樣本的金黃色葡萄球菌/沙門氏菌濃度（CFU/mL）。

取30份樣品（發酵乳），每份取25g，加入225mL，7.5%NaCl肉湯/BPW；然后再取25g，加入225mL 7.5%NaCl肉湯/BPW，添加金黃色葡萄球菌ATCC27217/沙門氏菌CICC21498約10⁰CFU。37℃增菌18h，從中取1mL進行核酸提取并使用金黃色葡萄球菌/沙門氏菌核酸檢測試劑盒進行檢測，其余增菌液按照國標方法繼續檢測并記錄最終檢測結果。

結果與分析

識別性和特異性檢測

金黃色葡萄球菌/沙門氏菌核酸檢測試劑盒對金黃色葡萄球菌/沙門氏菌陽性菌株及干擾菌的檢測結果如表1a/表1b，金黃色葡萄球菌/沙門氏菌核酸檢測試劑盒（PCR-探針法）對金黃色葡萄球菌/沙門氏菌的識別性和特異性均為100%。

表1a金黃色葡萄球菌核酸檢測試劑盒識別性和特異性

表1b沙門氏菌核酸檢測試劑盒識別性和特異性