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  • 發布時間:2020-09-14 18:01 原文鏈接: 金黃色葡萄球菌A蛋白(staphylococcalproteinA,SPA)夾心ELIS

    金黃色葡萄球菌A蛋白(staphylococcal protein A,SPA)可與IC中IgG的Fc段結合。將待測血清用低濃度PEG沉淀后加至SPA包被的固相載體上,再以酶標記的SPA與之反應,即可檢測樣本中有無IC。

    1、試劑

    (1)5%與2.5%PEG用0.02mol/LpH7.4PBS配制;

    (2)牛血清白蛋白(BSA)緩沖液:用0.05mol/L pH 7.4PBS配制。含0.01mol/L EDTA、0.1%硫柳汞、0.05%Tween 20及4%BSA;

    (3)HRP-SPA用改良過碘酸鈉法將SPA與辣根過氧化物酶(HRP)制成結合物,最適工作濃度以方陣法滴定;

    (4)熱聚合人IgG:人IgG 10mg/ml,63℃加熱20min制成。

    2、操作步驟

    (1)用PBS稀釋SPA成5Ps/ml,包被聚苯乙烯反應板微孔,每孔0.1ml(對照孔不包被),置4℃過夜后洗滌3次備用;

    (2)待測血清0.05ml加PBS0.15ml和5%PEG0.2ml混勻,4℃過夜后1600r/min離心20min,棄上清,沉淀用 2.5%PEG洗2次,加入PBS0.2ml和BSA緩沖液0.2ml,混勻,置37℃水浴30min,搖動,使完全溶解;


    (3)將已溶解的待測血清沉淀物加至上述包被孔和對照孔中,置37℃60min,洗3次;各孔加底物溶液(OPD—H202)0.1ml,37℃ 20min使呈色。每孔加2mol/LH2S041滴終止反應。置酶標儀492nm測各孔吸光值;

    (4)標準曲線制備:取正常人血清0.2ml,加熱聚合人IsC(120ug/ml)0.2ml,再加PBS0.4ml和5%PEG0.8ml,置 4℃過夜。同時做不加熱聚合人耽的正常血清對照,以排除血清中干擾因素。沉淀清洗同標本操作。用稀釋的BSA緩沖液(加等量 0.01mol/LpH7.4PBS)1.6ml溶解并稀釋成120、60、30、15、7.5ug/ml,與待測血清同法操作,制成工作標準曲線;


    (5)結果判斷:從待測血清吸光度值查標準曲線,即可換算成相當于熱聚合人IgG的CIC含量(ug/ml)。以高于正常對照X+2S,即大于 28.4ug/ml為陽性。

    3、注意事項

    (1)熱聚合人IgC應分裝貯存于-20℃,不宜反復凍融,否則易解聚;

    (2)PEG的濃度影響CIC沉淀量,須嚴格配制。


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