鑒定多糖的方法

1、方法提要
食品中相對分子質量>1×104的高分子物質在80%乙醇溶液中沉淀，與水溶液中單糖和低聚糖分離，用堿性二價銅試劑選擇性地從其他高分子物質中沉淀具有葡聚糖結構的多糖，用苯酚-硫酸反應以碳水化合物形式比色測定其含量，其顯色強度與粗多糖中葡聚糖的含量成正比，以此計算食品中粗多糖含量。

2、主要儀器
（1）分光光度計。
（2）離心機（3000r/min）。 （3）旋轉混勻器。

3、試劑
本方法所用試劑除特殊注明外，均為分析純；所用水為去離子水或同等純度蒸餾水。
（1）乙醇溶液（80%）：20mL水中加入無水乙醇80mL，混勻。
（2）氫氧化鈉溶液（100g/L）：稱取100g氫氧化鈉，加水溶解并稀釋至1L，加入固體無水硫酸鈉至飽和，備用。
（3）銅試劑儲備液：稱取3.0gCuSO4?5H2O，30.0g檸檬酸鈉，加水溶解并稀釋至1L，混勻，備用。
（4）銅試劑溶液：取銅試劑儲備液50mL，加水50mL，混勻后加入固體無水硫酸鈉12.5g并使其溶解。臨用新配。
（5）洗滌劑：取水50mL，加入10mL銅試劑溶液、10mL氫氧化鈉溶液，混勻。
（6）硫酸溶液（10%）：取100mL濃硫酸加入到800mL左右水中，混勻，冷卻后稀釋至1L。
（7）苯酚溶液（50g/L）：稱取精制苯酚5.0g，加水溶解并稀釋至100mL，混勻。溶液置冰箱中可保存1個月。
（8）葡聚糖標準儲備液：準確稱取相對分子質量5×105已干燥至恒重的葡聚糖標準品0.5000g，加水溶解，并定容至50mL，混勻，置冰箱中保存。此溶液1 mL含10.0mg葡聚糖。
（9）葡聚糖標準使用液：吸取葡聚糖標準儲備液1.0mL，置于100mL容量瓶中，加水至刻度，混勻，置冰箱中保存。此溶液1mL含葡聚糖0.10mg。

4、測定步驟
（1）樣品處理：
a、沉淀粗多糖：準確吸取液體樣品5.0mL，置于50mL離心管中，加入無水乙醇20mL，混勻5min后，以3000r/min離心5min，棄去上清液，反復操作3~4次。殘渣用水溶解并定容至5.0mL，混勻后，供沉淀葡聚糖。
b、沉淀葡聚糖：準確吸取b項終溶液2mL置于20mL離心管中，加入100g/L氫氧化鈉溶液2.0mL銅試劑溶液2.0mL，沸水浴中煮沸2min，冷卻，以3000r/min離心5min，棄去上清液。殘渣用洗滌液數毫升洗滌，離心后棄去上清液，反復操作3次，殘渣用10%（體積分數）硫酸溶液2.0mL溶液并轉移至50mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻。此溶液為樣品測定液。
（2）標準曲線的繪制：準確吸取葡聚糖標準使用液0、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL（相當于葡聚糖0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg）分別置于25mL比色管中，準確補充水至2.0mL，加入50g/L苯酚溶液1.0mL，在旋轉混勻器上混勻，小心加入濃硫酸10.0mL，于旋轉混勻器上小心混勻，置沸水浴中煮沸2min，冷卻后用分光光度計在485nm波長處以試劑空白溶液為參比，1cm比色皿測定吸光度值。以葡聚糖濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。
（3）樣品測定：準確吸取樣品測定液2.0mL置于25ml比色管中，加入50g/L苯酚溶液1.0mL，在旋轉混勻器上混勻，小心加入濃硫酸10.0mL于旋轉混勻器上小心混勻，置沸水浴中煮沸2min，冷卻至室溫，用分光光度計在485nm波長處，以試劑空白為參比，1cm比色皿測定吸光度值。從標準曲線上查出葡聚糖含量，計算樣品中粗多糖含量。同時做樣品空白實驗。

5、結果計算
(m1-m2)×V1×V3×V5 X= —————————— m3×V2×V4×V6式中 X—樣品中粗多糖含量（以葡聚糖計）（mg/g）；
m1—樣品測定液中葡聚糖的質量（mg）；
m2—樣品空白液中葡聚糖質量（mg）；
m3—樣品質量（g）；
V1 —樣品提取液總體積（mL）；
V2—沉淀粗多糖所用樣品提取液體積（mL）；
V3 —粗多糖溶液體積（mL）；
V4—沉淀葡聚糖所用粗多糖溶液體積（mL）；
V5—樣品測定液總體積（mL）；
V6—測定用樣品測定溶液體積（mL）。

6、準確度與精密度在不同食品中進行不同濃度的加標回收實驗，回收率為87.8%~110.87%，不同實驗室對同一樣品進行10次測定結果的相對標準偏差為5.8%。