鈣調蛋白的苯基Sepharose層析實驗

試劑、試劑盒 含鈣調蛋白的組分CaCl2(固體)碳酸氫銨緩沖液 E緩沖液 F
儀器、耗材 透析袋苯基-Sepharose*4B 填料玻璃層析柱 蠕動泵紫外線檢測器、分部收集器和硼硅玻璃試管凍干機 冷凍干燥器
實驗步驟 
材料與設備

含鈣調蛋白的組分，從 DEAE 柱收集后合并所得（見實驗 4)

透析袋（標稱截留分子量 6000~8000Da; 已清洗過)

苯基-Sepharose*4B 填料（已溶脹（Pharmacia Biotech,Inc.)

玻璃層析柱（直徑 2.5 cmX10 cm)

CaCl2(固體)

層析裝置：蠕動泵，紫外線檢測器、分部收集器和硼硅玻璃試管（13x100 mm)

碳酸氫銨（10 mmol/L;pH8.0)(8000 ml)

凍干機/冷凍干燥器

試劑

緩沖液 E(500 ml)

含 0.2mol/LNaCl 的緩沖液 E(200 ml)

含 8mol/L 尿素的緩沖液 E(100 ml)

緩沖液 F(500 ml)

含 0.2mol/LNaCl 的緩沖液 F(200 ml)

(配方，見“試劑的配制”，PP.82~83)

操作程序

一.透析

1) 戴上手套，將從 DEAE 柱收集后合并的含鈣調蛋白的組分轉移至透析袋。透析袋兩端至少打雙結扎緊，或用夾鉗夾緊。

2) 對緩沖液 F 透析過夜。

二.疏水作用層析

1) 用緩沖液 E(不含 NaCl) 洗滌苯基-Sepharose 填料，以除去儲存填料用的乙醇。于緩沖液 E 中以 50% 的懸漿儲存備用。

2) 將約 40 ml 的苯基-Sepharose 填料裝人一根 2.5x10-cm 的玻璃柱。用緩沖液 F(不含 NaCl), 以約 2 ml/min 的低流速淋洗幾個柱體積，平衡柱子。

3) 將透析袋中的存留液小心地轉人一燒杯中。記下體積。留取約 1% 供分析用，并記下該體積。不論透析后的樣品中含有什么，均加人固體 CaCl2 至終濃度 1 mmol/L，以保證鈣離子處于飽和狀態。

4) 給苯基-Sepharose 柱加樣，在加樣過程中讓樣品結合 30~60 min。

5) 用含 0.2mol/LNaCl 的緩沖液 F 洗柱約 2~4 體積（60~120 ml)。將清洗液收集于一燒杯或燒瓶中。

6) 除去柱頂部的所有緩沖液。用含 0.2mol/LNaCl 的緩沖液 E 洗脫，分部收集 2~4-ml 組分。監測紫外吸收，吸收峰回至基線后停止。

7) 用含 8md/L 尿素的緩沖液 E 徹底清洗柱子。用緩沖液 E 再生并保存柱子。

8) 對各組分作 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，檢測鈣調蛋白洗脫液。HIC 實驗的典型結果見圖 1-8。

9) 合并含鈣調蛋白的組分，對 10mmol/L 碳酸氫銨（pH8.0) 透析，然后凍干。稱量最終干燥的鈣調蛋白樣品。每千克（濕重雞胗組織一般能獲得 25~40 mg 的純鈣調蛋白。盡管碳酸氫銨容易揮發，但樣品中可能會有一些干重物不是蛋白質。可以將樣品溶于水后再凍干。另外，也可以對純水進行徹底透析，但在這樣的條件下可能會產生沉淀，而導致蛋白質回收的機械性損失。