長鏈非編碼RNA（lncRNA）研究策略

長鏈非編碼 RNA（long noncoding RNA，lncRNA）指的是轉錄本長度在 200-100000 nt 之間的 RNA 分子，它們不編碼蛋白，位于細胞核或胞質內，具有保守的二級結構。

研究顯示，lncRNA 并非以前所認識的那樣沒有功能，它可與蛋白質、DNA 和 RNA 相互作用，通過多種機制（如基因印記、染色質重塑、細胞周期調控、剪接調控、mRNA降解和翻譯調控等）在多種層面上（如表觀遺傳學、轉錄調控及轉錄后調控等）調控基因的表達水平。

lncRNA 參與多種生物學調控，在生命活動中發揮著重要的作用。隨著近些年來 lncRNA 相關論文發表量的成倍增加，該領域關注度也日益增高，已成為繼信使 RNA（mRNA）、小 RNA（microRNA、siRNA 等）之后功能基因組學最火熱的研究領域。

LncRNA 的經典研究思路如下：

現在很多人拿到測序結果或者芯片結果之后，無從下手。具體可以從以下幾個步驟著手：

第一步 確定差異lncRNA表達

利用 RT-PCR 或者 RT-qPCR 檢測 lncRNA 在不同細胞或者組織中的表達水平。

第二步 探究 lncRNA 特點

（1）通過 QD-FISH 原位雜交技術定位；或者通過細胞核質分離試劑盒得到 RNA，qRT-PCR 檢測其分布；
（2）全長序列試驗方法：通過 5′RACE 獲取 lncRNA5′ 全長， 3′RACE 獲取 lncRNA3′ 全長，最終得到 lncRNA 完整的全長序列。

第三步lncRNA的功能研究

lncRNA 較長，承載的信息量多，更容易形成高級結構，其功能具有多樣化和特異性強的特點。類似于 miRNA，探討 lncRNA 功能可用 gain/loss of function 策略，過表達或沉默 lncRNA 后觀察表型。即研究 lncRNA 功能獲得后或者功能缺失后對細胞增殖、凋亡、侵襲、轉移與克隆形成，以及病毒的轉錄復制等的影響。

（1）功能獲得性研究

構建 lncRNA 過表達質粒或者慢病毒、腺病毒包裝載體。原則上是將全長 lncRNA 定向克隆到表達載體上實現 lncRNA 的過表達。然而有些 lncRNA 很大或全長尚未分離，這時將視 lncRNA 在基因組上的定位采取不同的研究策略。在構建 lncRNA 表達質粒時，需關注 lncRNA 是否在蛋白編碼基因的啟動子區域或 3′-UTR 區域，勿遺漏重要區段。

（2）功能缺失性研究

可用 siRNA、shRNA、反義核酸、CRISPR/Cas9 等方法沉默 lncRNA，經 qRT-PCR 或 FISH 等驗證后觀察其對疾病相關基因表達和對細胞表型等的影響。

第四步 機制研究

lncRNA 可與蛋白質、DNA 和 RNA 相互作用，但是目前最常用的還是利用體外轉錄、RNA pull down、RNA-RIP（RNA Binding Protein Immunoprecipitation）、CHIRP-seq（Chromatin isolation by RNA Purification）、MS 等技術手段。

小知識：

RNA pull down 技術是檢測 RNA 結合蛋白與其靶 RNA 之間相互作用的重要實驗手段。利用體外轉錄法標記生物素 RNA 探針，然后與胞漿蛋白提取液孵育，形成 RNA-蛋白質復合物。該復合物可與鏈霉親和素標記的磁珠結合，從而與孵育液中的其他成分分離。復合物洗脫后，通過 Western Blot 實驗檢測特定的 RNA 結合蛋白是否與 RNA 相互作用。

RNA-RIP 技術是一種高通量檢測細胞內 RNA 與蛋白結合情況的技術，運用針對目標蛋白的抗體把相應的 RNA-蛋白復合物沉淀下來，然后經過分離純化就可以對結合在復合物上的 RNA 進行分析。RIP 技術下游結合 microarray 技術（被稱為「RIP-Chip」）幫助我們更高通量地了解癌癥以及其他疾病整體水平的 RNA 變化。

CHIRP-Seq 是一種檢測與 RNA 綁定的 DNA 和蛋白的高通量測序方法。采用生物素和鏈霉親和素探針把目標 RNA 拉下來后，則與其共同作用的 DNA 染色體片段就會附在磁珠上，最后把染色體片段做高通量測序，就會得到該RNA能夠結合在基因組的哪些區域；如果結合物是蛋白質，可以將蛋白質打斷成肽段進行質譜鑒定。

第五步 表達調控

將 lncRNA 表達與其他領域相結合，解釋其調控機理。（1）DNA 甲基化和乙酰化：可通過檢測相應基因甲基化、乙酰化差異與 lncRNA 結合分析。（2）轉錄因子：研究 lncRNA 與轉錄因子的調控機制。

第六步 體內驗證

有條件的實驗室，可以繼續在體內或者臨床樣本水平進行驗證。