間接免疫熒光

細胞培養在蓋玻片產生一抗種屬的二抗豬血清或其他封閉劑D-PBSA

新鮮制備的固定劑用含10%的FBS培養液封固劑

1. 用 D-PBSA 洗滌長有細胞的蓋玻片，置于合適的培養皿中。如 13 mm 蓋玻片可用24 孔板。

2. 將培養皿置于 -20°C，10 min，再加入冷的固定劑（5 % 醋酸乙醇溶液（放在 -20°C ）），靜置 20 min 。

3. 去除固定劑，在 D-PBSA 中洗蓋玻片，加入 1 ml 正常豬血清，室溫下放置 20 min。

4. 用 D-PBSA 中淋洗蓋玻片，用吸水紙吸干，將蓋玻片翻轉，置于一滴 50 μl 已稀釋的一抗（用含10 % 的 FBS 培養液，按1：100~1：1000比例稀釋）上。

5. 37°C 下放置 30 min 后，室溫 1~3 小時或 4°C 過夜，若在4°C 孵育，抗體可稀釋到 1：1000。

6. 用 D-PBSA 中淋洗蓋玻片，轉移到按 1：20 稀釋的二抗（對應于不同的產生一抗種屬的二抗（如一抗由兔產生，則二抗應來自不同種動物，如山羊抗兔免疫球蛋白）；二抗用熒光素或羅丹明標記）中，37°C 20 min。

7. 用 D-PBSA 中淋洗蓋玻片，用含 50 % 甘油和熒光淬滅延遲劑（Vecta）的 D-PBSA 封間于載玻片上。

8. 用熒光顯微鏡觀察玻片。