間接原位PCR（原位雜交PCR）實驗

實驗材料 組織或細胞樣品

試劑、試劑盒 SSC硫酸葡聚糖甲酰胺脫脂奶粉Denhardt’s 液SDS變性的鮭魚精DNARnaseDTT乙醇

儀器、耗材 玻片石蠟膜橡皮泥濕盒

實驗步驟

一、預雜交

1.   試劑與配制

2×SSC

50%去離子甲酰胺：用4×SSC配制（v/v）

預雜交液：2×SSC，5%硫酸葡聚糖，50%甲酰胺，0.2%脫脂奶粉

2.   操作方法

（1）在進行完原位PCR擴增后，用2×SSC預浸經乙醇脫水、空氣干燥的玻片，并簡洗15 min；

（2） 用50%去離子甲酰胺37℃孵育15 min；

（3）加預雜交液20 μl/片，在雜交溫度下孵育30 min～2 h。

二、雜交

1.  試劑與配制

雜交液：50%去離子甲酰胺，5×SSC，10%硫酸葡聚糖，5×Denhardt’s 液，2%SDS，10 mg/ml變性的鮭魚精DNA

2.  操作方法

（1）棄預雜交液，加雜交液（含0.2～5 μg/ml探針）10～20 μl/片，覆蓋經硅化的蓋玻片，石蠟膜封片或橡皮泥封片；

（2）玻片置于濕盒中，42℃雜交12～18 h（過夜，但不能超過24 h）。

三、雜交后處理

1.  試劑與配制

2×SSC

Rnase（20 μg/ml）

50%去離子甲酰胺

10 mmol/L DTT

2.   操作方法

1.   雜交完畢，用2×SSC浸泡玻片數分鐘，輕輕移去蓋玻片，再用2×SSC洗玻片1～2 min；

2.   2×SSC（含20μg/ml RNase，適宜RNA探針，DNA探針可省略此步）中洗片30 min，37℃；

3.   2×SSC/50%去離子甲酰胺，42℃×10 min；

4.  1×SSC/50%去離子甲酰胺，37℃×30 min，2次；

5.   4×SSC/10 mmol/L DTT洗1 h；

6.   0.1×SSC洗2次，每次37℃×30 min；

7.   PBS中洗10 min，即可進行顯色，方法同上。

注意事項

1.  如果檢測mRNA，雙鏈探針應變性處理，方法是95～100℃加熱10 min后迅速置于冰中驟冷；

2.   以單鏈探針檢測DNA時，DNA也需變性處理，將玻片置于70～80℃變性液（70%去離子甲酰胺，即甲酰胺/2×SSC，v/v）中10 min；

3.   用雙鏈探針檢測DNA時，可按上述方法變性處理。