1、用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg/ml，每孔加0.1ml，4℃過夜；
2、次日洗滌3次；
3、加一定稀釋的待檢樣品（未知抗體）0.1ml于上述已包被之反應孔中,置37℃孵育1小時,洗滌；
4、（同時做空白、陰性及陽性孔對照）于反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標第二抗體（抗抗體）0.1ml；
5、37℃孵育35-60分鐘，洗滌；
6、最后一遍用DDW洗滌。
其余步驟同“雙抗體夾心法”的4、5、6。
