實驗概要
構建并篩選含有目的基因的候選陽性重組克隆。有助于理解目的基因與克隆載體的連接、轉化和篩選原理及流程。
實驗原理
1. 連接反應：利用經過限制性內切酶消化的線形載體與目的基因兩端暴露出的平末端或相同的粘性末端，使用T4 DNA 聚合酶將二者連接起來形成重組載體。
2. 轉化過程：感受態細胞通過溫度敏感性攝入重組載體，并在含有抗生素的LB瓊脂平板培養基上進行表達及擴增形成單一克隆。
3. 菌落PCR：以單一菌落為模板進行PCR 擴增，獲得含有目的基因的候選陽性重組克隆。
克隆原理示意圖
主要試劑
1. 連接反應試劑盒
2. 感受態細胞E. coli JM109
3. SOC 培養基（每升含有胰蛋白胨20 g，酵母提取物5 g，NaCl 0.5 g，1 M葡萄糖20 ml）
4. 含有抗生素（Kanamycin，終濃度50 μg/ml 或Ampicillin，終濃度100 μg/ml）的LB 瓊脂平板培養基（每升含有胰蛋白胨10 g，酵母菌提取物5 g，NaCl 5 g，1M NaOH 1 ml）
5. PCR 反應體系
主要設備
1. 電熱恒溫水槽
2. 水平振蕩搖床
3. 細菌培養箱
4. PCR 擴增儀
5. 電泳儀及水平電泳槽
6. 凝膠自動成像分析系統
實驗材料
目的基因和載體片段
實驗步驟
1. 連接反應
37℃水浴孵育2 h 或16℃過夜。
2. 重組載體DNA 的轉化
1) 取感受態細胞E.coli JM109 60 μl 于滅菌的1.5 ml Eppendorf 管中，加入5 μl 連接產物，輕輕旋轉混合內容物，于冰中放置30 min；
2) 42℃中放置45 sec 后立即放入冰中；
3) 3 min 后加入37℃預熱的SOC 培養基940 μl，37℃ 225 rpm 振蕩培養1 h；
4) 取50 μl 轉化物涂布于含抗生素的LB 瓊脂平板培養基1 ml 中，37℃培養過夜。
3. 菌落PCR 鑒定重組陽性克隆在生長的菌落中，隨機各挑取5～10 個獨立圓滑的菌落，通過PCR 的方法對重組載體進行篩選。
反應體系：
反應條件：94℃ 5 min，94℃ 30 sec、68℃ 3 min、25 cycles，68℃ 5 min。
PCR 產物經1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測確定陽性克隆并照相。
注意事項
1. 連接體系中使目的基因片段與線形載體片段摩爾濃度比達到3：1，為理想連接反應比例。
2. 連接反應時間，如為粘性末端連接則連接反應條件為37℃水浴孵育3 h即可，如為平末端連接則16℃過夜為宜。
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