陳玉林教授團隊新技術流程用于創制基因編輯綿羊模型

　　近年來，以基因編輯技術為代表的家畜分?設計育種技術迅速發展。CRISPR/Cas9基因編輯技術是具有簡單、高效、精確等優點的新型基因編輯?具，將其應用于家畜育種，有望對多個基因實現同步的精準編輯，提高家畜選育的精準度，縮短育種周期，加快育種進程。綿羊是重要的經濟動物，更是基因編輯的模式動物，研究綿羊的基因編輯對動物生產性能的改良、生物醫學和生物制藥的研究具有重要的意義。

　　西北農林科技大學陳玉林教授團隊采用CRISPR/Cas9系統創制了編輯不同基因的綿羊群體，針對不同基因的相關性狀展開了研究。其中相關技術的完整實驗流程以Multiplex Gene Editing viaCRISPR/Cas9 System in Sheep（www.bio-protocol.org/e2385）為題整理發表在Bio-Protocol雜志，供研究人員參考和應用。

　　CRISPR/Cas9（Clustered regularly interspaced short palindromicrepeats/ CRISPR associated protein 9）介導的基因編輯技術是當今研究基因功能的重要手段之一，研究人員利用該系統在不同物種上揭示了許多重要基因的生物學功能。CRISPR/Cas系統是細菌和古細菌內通過RNA介導的特異性切割外源遺傳物質的獲得性免疫系統。II型CRISPR/Cas系統即CRISPR/Cas9已經被證明可以在試管中高效切割任意給定的DNA。CRISPR/Cas9與傳統的ZFN和TALEN技術相比具有效率高、序列選擇限制小（只需要基因組上出現GG即可）、易實現多位點打靶、構建過程相對簡單等優點。

　　在這項實驗中，研究人員選取了具有抑制肌肉發育功能的肌肉生長抑制素（Myostatin，MSTN）基因、影響脂肪顏色的β -胡蘿卜素雙脫氧加氫酶（β-carotene-9',10'-dioxygenase，BCO2）基因和影響毛色的刺鼠信號蛋白（Agouti Signal Protein，ASIP）基因作為目標基因。設計相應的sgRNA，經過細胞水平編輯效率檢測后選擇最優的sgRNA作為CRISPR/Cas9系統的向導RNA注射入灘羊（寧夏綿羊）受精卵細胞質中，經體外培養后移植入雌性灘羊輸卵管中，用于生產同時敲除MSTN、ASIP、BCO2基因的基因編輯灘羊，最終共獲得羔羊54只（活羔36只）。其中，MSTN基因編輯陽性羊 27.8%（10/36），ASIP基因編輯陽性羊 33.3%（12/36），BCO2基因編輯陽性羊27.8%（10/36）。隨后，試驗人員采取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、皮膚、肌肉、睪丸或卵巢的組織樣品，進行PCR 擴增、T7E1酶切和Sanger測序分析，證明了Cas9介導的基因編輯存在于內、中、外三個胚層。同時團隊成員對基因編輯陽性羊的生殖細胞進行檢測，充分證明了基因編輯個體可以穩定地將突變遺傳給后代。另外，該團隊持續監測了MSTN陽性羊和野生型羊從出生至 240天的體重情況，MSTN陽性灘羊的體重均顯著高于野生型羊，且陽性羊的肌纖維直徑更寬、肌纖維橫截面積更大，表明MSTN基因突變造成基因編輯綿羊肌肉發育能力的提高。值得提及的是，團隊成員對基因編輯羊進行了家系全基因組測序，全面分析了基因編輯羊基因組上的新發突發、插入或缺失和結構變異的數據；除發現一個2.4kb DNA倒置（發生在MSTN的兩個sgRNA靶向位點之間一個低發病率的基因座上）外，其它脫靶突變影響幾乎可以忽略不計。他們同時利用家系數據系統的篩查了基因編輯山羊后代中新發突變的發生情況，發現基因編輯動物及其后代中的新發突變頻率與對應的自然群體（綿羊、山羊）和其他物種（人、牛等）無異。該結果表明基因編輯技術并未在全基因組上引入更多的潛在突變，初步證明了該技術的安全性及可用于動植物育種和生物醫學研究。