陳玲玲團隊開發活細胞DNA成像新工具——CRISPRdelight

　　活細胞追蹤DNA、RNA等核酸的空間分布和動態變化對于了解基因表達調控機制具有十分重要的意義。CRISPR-Cas系統是一種來源于細菌和古細菌體內的獲得性免疫系統，由于其特異性靶向DNA/RNA的能力，已被廣泛開發成多種細胞內DNA/RNA的遺傳操作和檢測標記的工具。

　　陳玲玲研究組前期構建了基于CRISPR-dCas13的RNA標記系統，成功實現了對活細胞和斑馬魚胚胎內RNA的成像追蹤，以及活細胞RNA多色成像。此外，經過改造的靶向DNA的CRISPR-Cas9系統可用于活細胞DNA成像標記。這些CRISPR系統在標記內源核酸序列方面顯示出獨特的優勢，然而對于非重復DNA/RNA序列的活細胞特異性成像目前仍存在著諸多限制。

　　CRISPR-Cas12a系統屬于類型V的CRISPR-Cas家族，在靶向DNA的同時還具備將CRISPR串聯序列加工成多條成熟crRNA的能力。因此，CRISPR-Cas12a系統理論上可以通過CRISPR串聯序列在同一細胞內表達足夠數量的crRNA，從而實現對非重復序列DNA的標記。

　　2024年7月4日，中國科學院分子細胞科學卓越創新中心（生物化學與細胞生物學研究所）陳玲玲研究組在 Nature Methods 期刊發表了題為：CRISPR array-mediated imaging of non-repetitive and multiplex genomic loci in living cells 的研究論文。

　　該研究對現有的CRISPR-dCas12a系統進行了篩選優化，構建了可用于非重復序列DNA活細胞成像的CRISPRdelight系統；進一步利用CRISPRdelight系統揭示了基因位點在細胞核內的定位與其運動能力和轉錄活性的相關性；同時利用RNA適配體修飾的CRISPR串聯序列實現了對4種衛星DNA的活細胞多色成像。

　　在這項研究中，研究團隊選取了三種已報道的能顯著提高基因編輯效率的dLbCas12a突變體，并對它們在標記微衛星DNA Sat I和Sat III方面的能力進行了比較。結果顯示，hyperdLbCas12a突變體（D156R、D235R、D292R、D350R）可以實現更高的標記效率和信號質量（圖1）。研究團隊進一步發現hyperdLbCas12a可以加工CRISPR串聯序列，并維持與直接表達成熟crRNA近似的DNA標記能力，同時篩選出了能夠表達長達50次crRNA重復序列的CAG啟動子，并基于此構建了用于活細胞DNA成像的CRISPRdelight系統。

　　研究團隊針對CCAT1轉錄起始位點上游10kb的區域設計了48條gRNA，使用CRISPRdelight系統成功實現了CCAT1基因位點的活細胞標記（圖2）。以同樣的方式，CRISPRdelight系統在其他6個非重復序列基因位點均得到了有效驗證，并且該系統在HCT116、U2OS以及小鼠胚胎干細胞（R1）中同樣有效。

　　CRISPRdelight系統相較于之前報道的基于CRISPR-dCas9的CARGO活細胞標記系統，具有質粒構建成本低、周期短、可表達gRNA數量多、標記系統組成更簡潔等多方面優點。

　　研究團隊利用CRISPRdelight系統進一步分析了CCAT1在細胞核內的分布特點和運動特征。研究結果顯示，位于細胞核膜處Lamin蛋白層的CCAT1位點運動能力明顯弱于位于細胞核內的CCAT1位點；進一步檢測CCAT1的內含子表達信號，發現Lamin蛋白層的CCAT1位點轉錄活性也更弱（圖3）。同時，研究團隊對HSPH1、HSPA1A等熱休克基因進行了標記，在向細胞施加42°C或亞砷酸鈉刺激后，發現定位于核斑的HSPH1基因位點會明顯增多，并且位于核斑的基因位點轉錄活性也明顯更強。這些結果表明了基因組DNA的細胞核內空間位置與其運動能力和表達活性的相關性。

　　最后，研究團隊通過RNA結構優化，成功將BoxB、Pepper、PP7和MS2 等RNA適配子元件插入至gRNA中，利用CRISPRdelight系統和這些元件對應的融合熒光蛋白，實現了微衛星DNA Sat I、Sat II、Sat III和Sat α的活細胞四色標記（圖4）。CRISPRdelight系統為研究活細胞中DNA位點的空間位置和動力學特征，提供了更簡單和便利的新手段。

　　中國科學院分子細胞卓越中心楊良中博士（已畢業）、敏逸暉碩士和劉昱昕博士為該論文的共同第一作者，陳玲玲研究員為通訊作者。該項工作得到霍華德休斯醫學研究所Zhe (James) Liu教授、復旦大學生物醫學研究院/復旦大學附屬兒科醫院楊力研究員、清華大學王海峰博士的大力支持。該研究獲得分子細胞卓越中心細胞分析技術平臺的技術支持，并獲國家自然科學基金、科技部、中國科學院及上海市科委的基金支持。