本文建立了高分離度快速液相色譜(RRLC)分離7種常見降糖中藥中化學藥品的分離方法與單四極質譜（MSD）的檢測方法。對中成藥中添加的降糖西藥用RRLC快速分離，用DAD檢測器得到的色譜圖和光譜圖進行定性，并使用單四極質譜檢測器進行定量與定性鑒別；同時采用液質聯用方法測定中成藥中添加這些化學藥品的加樣回收率。結果七個對照品均產生[M+H]+分子離子峰，對于兩種不同樣品基質的加標回收率在64.4%~100.7%之間。因此，該方法可作為檢測降糖中成藥中非法添加化學藥品的通用方法。
實驗條件
液相色譜條件
■Agilent 1200 SL系列液相色譜儀，配置有G1312B二元泵（低延遲體積配置），G1379B脫氣機，G1367C自動進樣器，G1316B柱溫箱，1315C二極管陣列檢測器。
■色譜柱：ZORBAX SB C18 （2.1×50 mm，1.8μm）。
■流動相為乙腈：0.2%甲酸水溶液；梯度：0~4min，乙腈：10%~90%；Stop time：6min；Postrun：3min。
■流速：0.4ml/min。
■柱溫：40℃。
■進樣量：2μl。
■檢測波長：235nm。
■質譜分析條件
■Agilent 6130單四極桿質譜儀，配置了ESI離子源。
■在（+）ESI模式下，采集數據。
■經實驗優化設定質譜參數如下：Capillary3000 V，Drying Gas 8 L/min，Neb Press 35 psi，Gas Temp 350℃，Fragmentor 70。
試劑與試藥
甲醇、乙腈（HPLC級，Merck，Darmstadt Germany），甲酸（HPLC，Merck，Darmstadt Germany），純凈水（樂百氏食品飲料有限公司）。
圖1. 七種對照品的質譜分析結果-SIM。
對照品包括雙胍類：鹽酸二甲雙胍；磺酰脲類：格列美脲、格列吡嗪、格列齊特、格列本脲；其他：鹽酸吡格列酮、瑞格列奈。上述皆購自中國藥品生物制品鑒定所。
供試藥品共12種，包括：消渴丸、降糖甲片、消渴靈片、金芪降糖片、濃縮苦瓜粉膠囊、降糖膠囊、糖尿樂膠囊、止渴降糖膠囊、地骨降糖膠囊、十八味訶子利尿膠囊、降糖寧膠囊、珍芪降糖膠囊。上述皆為市售藥品。
實驗方法
對照品配制
分別精密稱取鹽酸二甲雙胍、格列美脲、格列吡嗪、格列齊特、格列本脲、鹽酸吡格列酮、瑞格列奈10mg，加入50ml容量瓶中，加入適量甲醇超聲溶解，甲醇定容得到儲備液，取儲備液用甲醇稀釋10倍得到DAD檢測時的工作溶液（~20μg/ml），將上述工作溶液稀釋20倍得到MS檢測時的工作溶液（約為~1.0μg/ml）。
供試品提取方法
片（丸）劑：取片（丸）劑10片（粒），稱重，研磨粉碎成細粉，置50ml容量瓶中，甲醇定容，超聲提取15min，放至室溫后，補足損失體積，提取液過0.45μm濾膜，液相分析，UV檢測器，使用質譜檢測器時，需稀釋20倍進樣。
圖2. 消渴丸RRLC-UV色譜圖（下）以及與混合標準樣品色譜圖比較（右上）。
膠囊內容物：取膠囊10粒，完全取出內容物，稱重，后面操作同片劑。
膠囊外殼：膠囊殼10粒，稱重，用粉碎機粉碎成細粉，稱相當于2個膠囊殼的重量，至10ml容量瓶中，后操作同片劑。
回收率實驗
取兩種不同的陰性檢出樣品基質（片劑和膠囊內容物），分別加入對照品，按照樣品前處理方法處理，測定，用SIM譜圖計算加樣回收率，同時做空白加入的平行實驗（每種基質加標和空白各兩份）。
結果和討論
波長選擇
由光譜圖可以看出，被檢測物質由于結構中不含有強的共軛結構，所以紫外最大吸收都處于較低波長，即在220~240nm之間，故紫外檢測波長選定為235nm。
流動相的選擇
目標組分均含氮原子，故采用用甲酸體系進行分離時，可產生較好的正離子信號。因七種物質結構不同，疏水性差異大，故采用梯度色譜進行分離。分離結果表明，除了在流動相條件下不保留的鹽酸二甲雙胍，其他幾種被檢測物質均有良好的保留與分離，并且整個分離在6分鐘之內完成。因采用甲酸為流動相組分，且分離采用梯度方法，故在低波長下（235nm）紫外檢測的基線有明顯的變化。但對待測物質的質譜檢測和分離沒有影響（見圖1）。其中瑞格列奈因其兩性官能團結構，在該流動相條件下色譜峰較其他組分相比有一定程度的展寬。
本工作使用2.1mm內徑的色譜柱，流速0.4ml/min，可以不分流直接進入質譜分析，有助于獲得良好的質譜信號。由于不使用高濃度緩沖鹽等極端條件，此方法對色譜柱損害很小，進樣135針，柱效無明顯降低。
供試樣品分析結果
雖然只有七種對照品，但是質譜檢測時，同時對十二種違禁添加成分的分子離子進行了掃描，供試樣品中未發現七種對照品之外的目標組分。未檢出上述12種違禁添加成分的供試品有10種：降糖甲片、消渴靈片、金芪降糖片、濃縮苦瓜粉膠囊、降糖膠囊、糖尿樂膠囊、止渴降糖膠囊、地骨降糖膠囊、十八味訶子利尿膠囊、降糖寧膠囊。
圖3. 消渴丸RRLC-SIM色譜圖（下）以及與混合標準樣品色譜圖比較（左上）。
陽性檢出樣品
在消渴丸中檢測出格列本脲。外標法計算含量約為2.8mg/片（本藥品說明書中明確標明有陽性添加格列本脲，2.5mg/片），與藥品說明書中的含量相符。珍芪膠囊中檢測出標簽中未標注的違禁化學藥物瑞格列奈。
由色譜圖可見：陽性樣品不僅在質譜分析中可以觀察到相應的色譜峰，在DAD采集的紫外色譜圖上亦可發現較強的色譜信號（圖2和圖3），且DAD采集的相應的色譜峰的紫外光譜亦可對色譜峰提供有價值的確認信息。因此，RRLC-DAD可以作為目標組分陽性的快速篩查手段。但因中藥成分復雜多變，簡單方法很難實現不同基質中所有成分在色譜上的完全分離，故DAD常常可能得到的是混合的色譜和光譜信息。在進行陽性確認時，需要質譜等手段進行進一步鑒定。
單四極質譜檢測器作為陽性篩查與鑒定之簡單、易用的方便手段，可以對大多數樣品進行分析鑒定。
鹽酸二甲雙胍的確認
鹽酸二甲雙胍極性很強，在色譜柱上不保留，在分離檢測過程中，會受到基質中強極性物質（如糖類物質等）的干擾，造成較低的回收率和結果的不確定性。但因其需要加入的劑量較大，故即便有離子抑制現象發生，亦可檢出。鑒于實際供試樣品的UV和SIM分析結果中往往在二甲雙胍的保留時間處可以看到色譜峰，故在對所檢測藥品進行陽性確證時，需要質譜進行進一步確證。