降落PCR

基于PCR原理三步驟而設置變性-退火-延伸三個溫度點。在標準反應中采用三溫度點法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40 ～60℃，引物退火并結合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因(長度為100～300bp時)可采用二溫度點法， 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性)。

　　①變性溫度與時間：變性溫度低，解鏈不完全是導致PCR失敗的最主要原因。一般情況下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA變性，若低于93℃則需延長時間，但溫度不能過高，因為高溫環境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產物完全變性，就會導致PCR失敗。

　　②退火(復性)溫度與時間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發生結合。由于模板DNA 比引物復雜得多，引物和模板之間的碰撞結合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。對于20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想。引物的復性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：

　　　　　Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)

　　　　　復性溫度=Tm值-(5～10℃)

在Tm值允許范圍內， 選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合， 提高PCR反應的特異性。復性時間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間完全結合。

③延伸溫度與時間：Taq DNA聚合酶的生物學活性：

　　　　　　　　　70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子

　　　　　　　　　70℃ 60核苷酸/S/酶分子

　　　　　　　　　55℃ 24核苷酸/S/酶分子

　　　　　　　　　高于90℃時， DNA合成幾乎不能進行。

PCR反應的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間，常用溫度為72℃，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結合。PCR延伸反應的時間，可根據待擴增片段的長度而定，一般1Kb以內的DNA片段，延伸時間1min是足夠 的。3～4kb的靶序列需3～4min；擴增10Kb需延伸至15min。延伸進間過長會導致非特異性擴增帶的出現。對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些。

　　循環次數　　循環次數決定PCR擴增程度。PCR循環次數主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環次數選在30～40次之間，循環次數越多，非特異性產物的量亦隨之增多。

基因樣品

引物 去離子水 DNA聚合酶 緩沖液 dNTP MgSO4(可選)和DMSO（可選）

PCR

1.  反應體積為50 ul。

2.  人CD137胞膜外區基因的PCR擴增體系：CD137-pCDNA3質粒4 ul，P1，P2各0.5 umol/L，MgCl₂ 2 mmol/L，dNTP 0.4 mmol/L，Taq 5 U。

3.  hIgG1Fc片段的PCR擴增體系：含人hIgG1Fc的PGEM-T質粒4 ul，P3、P4各0.4 umol/L，MgCl₂ 2 mmol/L，dNTP 0.4 mmol/L，Taq 5 U。

4.  HBVDNA多聚酶基因的PCR擴增體系：

（1）第一輪：HBVDNA模板4 ul，P5、P6各0.25 umol/L，MgCl₂ 1.5 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，Taq 0.8 U.

（2）第二輪：取5倍稀釋的第一輪PCR產物4 ul為模板，P7、P8各0.25 umol/L，MgCl₂ 1.5 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，Taq 0.8 U。

5.  分別在各滅菌PCR管加入上述各反應成分，100℃煮沸5 min，立即冰浴5 min，加入TaqDNA聚合酶，混勻，離心，PCR程序如下：

6.  取 10 ul PCR 擴增產物，在2%或3%瓊脂糖凝膠上電泳，紫外燈下觀察擴增產物。

由于目標是在較早的循環中避免低Tm值配對，在TD-PCR中最好應用熱啟動技術。設計時，退火溫度的范圍應跨越15℃左右，從高于估計Tm值至少幾度到低于它10℃

1、若無條帶：

（1）反應體系錯誤。重新配置反應體系確保各種試劑加入的量沒有問題。

（2）PCR程序出錯。檢測PCR儀程序是否正確。

（3）DNA膠問題。DNA凝膠電泳時加入陽性對照。

（4）退火溫度不合適。以2度為梯度設計梯度PCR反應優化退火溫度。

（5）DNA模板量太少。增加DNA模板量。

（6）引物錯誤。利用BLAST檢查引物特異性或重新設計引物。

（7）DNA模板中存在抑制劑。確保DNA模板干凈

（8）模板有復雜結構。加入DMSO,BSA或者甜菜堿。可嘗試遞減PCR。

2、PCR產物量過少：

（1）延伸時間太短。以1kb/分鐘的原則設置延伸時間。

（2）變性時間過長。變性時間過長會導致DNA聚合酶失活。