不同限制性核酸內切酶識別和切割的特異性不同。DNA在限制性內切核酸酶的作用下，使多聚核苷酸鏈上磷酸二酯鍵斷開的位置被稱為酶切位點（或稱為靶序列），可用↓表示。絕大多數的Ⅱ型限制性核酸內切酶，都能識別48個核苷酸組成的特定酶切位點，并且一般是在識別序列內部，如C↓GATCC、AT↓CGAT、GTC↓GAC、CCGC↓CC、AGCGC↓T等。
少數限制性內切核酸酶在DNA上的酶切位點在識別序列的兩側，如↓GATC、CATG↓、↓CCAGG等，有些識別序列是連續的（如GATC），有些識別序列是斷裂的（如GANTC），但它們共同的特點是具有雙重旋轉對稱的結構形式，即回文結構。Ⅱ型限制性核酸內切酶的靶子位點是多樣的，靶序列長度不一樣的限制酶，對DNA分子的隨機切割頻率不同。DNA分子經限制性內切核酸酶酶切產生的DNA片段末端，因所用限制性內切核酸酶不同而不同。兩條多聚核苷酸鏈上磷酸二酯鍵斷開的位置如果是交錯的，產生的DNA片段末端的一條鏈多出1至幾個核苷酸，這樣的末端稱為黏性末端。DNA片段末端的3′端比5′端長的稱為3′黏性末端，DNA片段5′端比3′端長的稱為5′黏性末端。如果兩條多聚核苷酸鏈上磷酸二酯鍵斷開后產生的DNA片段末端是平齊的，稱之為平末端。不管是黏性末端還是平末端，5′端一定是：-P基團，3′端一定是：-OH基團。一些限制性內切核酸酶雖然來源不同，但是具有相同的識別序列，形成不同的或同樣的末端，這樣的限制性內切核酸酶被稱為同裂酶（isoschizomer），如emphasis：role=italicHpaemphasisⅡ和emphasis：role=italicMspemphasisI是一對同裂酶，共同的靶子序列是CCGG。emphasis：role=italicBamemphasisHI和emphasis：role=italicBstemphasisI為同裂酶，具有相同的識別序列GGATCC。emphasis：role=italicSmaemphasisI和emphasis：role=italicXmaemphasisI，它們均識別5′CCCGGG3′，但前者切后產生鈍末端，后者切后產生黏性末端。同裂酶之間的性質有所不同（如對離子強度、反應溫度以及對甲基化堿基的敏感性等方面可能有所差別）。如emphasis：role=italicMboemphasisI和emphasis：role=italicSauemphasis3AI識別和切割位點相同，但其差異就在于前者對甲基化敏感。同裂酶可以具有不同的酶切位點，也可以具有相同的酶切位點。前者肯定是兩種不同的限制性內切核酸酶，而后者往往是從不同生物中提取到的同一種限制性內切核酸酶。有些限制性內切核酸酶雖然識別序列不同，但是酶切DNA分子產生的DNA片段具有相同的黏性末端，稱這樣的一組限制性內切核酸酶為同尾酶（isocaudamer）。
如emphasis：role=italicTaqemphasisI，emphasis：role=italicClaemphasisI和emphasis：role=italicAccemphasisI為一組同尾酶，其中任何一種酶酶切DNA分子，均產生5′-GG黏性末端。由同尾酶產生的DNA片段，是能夠通過其黏性末端之間的互補作用彼此連接起來的。如emphasis：role=italicEcoemphasisRI和emphasis：role=italicMunemphasisI屬于同尾酶，emphasis：role=italicMunemphasisI的識別序列是：inlinemediaobjectimageobjectimagedata：fileref=..19787109123878010001image19787109123878010001_0094_1.gifimagedataimageobjectinlinemediaobject，emphasis：role=italicEcoemphasisRI的識別序列和切割位點：inlinemediaobjectimageobjectimagedata：fileref=..19787109123878010001image19787109123878010001_0094_2.gifimagedataimageobjectinlinemediaobject。又如常用的限制酶emphasis：role=italicBamemphasisHI、emphasis：role=italicBclemphasisI、emphasis：role=italicBglemphasisⅡ、emphasis：role=italicSauemphasis3AI和emphasis：role=italicXhoemphasisⅡ也是一組同尾酶，它們切割DNA之后都形成GATC：4個核苷酸組成的黏性末端，且由emphasis：role=italicSauemphasis3AI和emphasis：role=italicBamemphasisHI同尾酶形成的雜種位點，對emphasis：role=italicSauemphasis3AI則仍然是敏感的，但已再不是emphasis：role=italicBamemphasisHI的靶子位點。值得注意的是，多數同尾酶產生的黏性末端一經連接，重組分子便不能用任何一種同尾酶在相同的位點切開。
例如，emphasis：role=italicBamemphasisHI（識別序列為GGATCC）水解的DNA片段與emphasis：role=italicBglemphasisⅡ（識別序列為AGATCT）切開的片段連接后，所形成的重組分子在兩個原切點處均不能為emphasis：role=italicBamemphasisHI和emphasis：role=italicBglemphasisⅡ切割，這種現象稱為酶切口的“焊死”作用。只有在少數情況下，由兩種同尾酶產生的黏性末端經連接后可被其中一種酶切開。例如，emphasis：role=italicEaeemphasisI的識別序列為5′PyGGCCPu：3′，emphasis：role=italicEayemphasisI的識別序列為5′CGGCCG：3′，它們形成的黏性末端相同，連接后的重組分子序列5′PyGGCCG3′僅能為emphasis：role=italicEaeemphasisI所識別，顯然這種情況依賴于限制性內切酶識別序列的相對專一性。同尾酶在基因重組操作中有特殊的用途。