限制性內切酶消化DNA實驗

限制性內切酶 DNA片段

TE 酶切緩沖液 EDTA

恒溫水浴鍋

1.  混合下列溶液于一個無菌的微量離心管中

（1）x μl  DNA

（2）2 μl  10×酶切緩沖液

（3）18-x μl  H₂O

（4）20 μl 的反應體積可以方便地用于聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠電泳分析。

（5）只要反應混合物中其他成分的比例保持一定，可增減待切割DNA的量和反應條件。

2.  加入限制性內切酶（1——5 U/μg DNA）在推薦的溫度溫育1 h （—般是37℃）。

3.  理論上，1 U 限制性內切酶在推薦的反應條件下，60 min 內可完全消化1 μg 純化的樣品。

4.  酶的體積應低于反應總體積的1/10，因為酶液中的甘油可以干擾反應。

5.  加入5 μl 電泳加樣緩沖液終止反應，進行瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳。

6.  反應也可通過加入0.5 μl 0.5 mol/l EDTA（終濃度為12. 5 mol/l） 以螯合鎂離于而終止。

7.  很多酶再65℃溫育10 min 可被不可逆滅活，有些不能在65℃熱失活的酶在75℃溫育15 min 也能失活。

8.  如果酶對熱具完全抗性，可遍過酚抽提和乙醇沉淀或通過硅基質懸浮法來純化DNA。

在選擇限制性內切酶時, 應選擇在插入片段中單獨存在和在插入片段與質粒序列中均含有的限制性內切酶酶切位點 ,這樣可保證酶切片段大小能滿足進一步分析的需要。

1.分子克隆是微量操作技術，DNA樣品與限制性內切酶的用量都極少，必須嚴格注意吸樣量的準確性及全部放入反應體系中。

2.要注意酶切時加樣的次序，一般次序為水、緩沖液、DNA各項試劑，最后才加酶液。取液時，Tip頭要從溶液表面吸取，以防止Tip頭沾去過多的液體與酶，待用的內切酶要放在冰浴內，用后蓋緊蓋子，立即放回-20℃冰箱，防止限制性內切酶的失活。

3.凡用在酶切反應中的一切塑料器皿（Eppendorf管，Tip頭等），都要新的，最后用重蒸水清洗，濕熱滅菌，置50℃溫箱中烘干，使用前打開包裝，用鑷子夾取，不直接用手去拿，嚴防手上雜酶污染。

4.當樣品在37℃與65℃保溫時，要注意：

（1）防止因蓋子未蓋嚴密使水汽進入管內，使反應溶液體積大量增加，造成實驗失敗。

（2）防止由于標簽脫落，分不清樣品類型。

5.由于溫差原因，往往在蓋上有水汽，因此樣品酶切完畢或中間取樣電泳要離心2秒鐘，以集中體積內溶液，否則會發現酶切后體積少了。