限制性片段長度多態性（RFLP，Restriction Fragment Length Polymorphism）RFLP技術于1980年由人類遺傳學家Bostein提出。它是第一代DNA分子標記技術。Donis—Keller利用此技術于1987年構建成第一張人的遺傳圖譜。DNA分子水平上的多態性檢測技術是進行基因組研究的基礎。RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism,限制片段長度多態性)已被廣泛用于基因組遺傳圖譜構建、基因定位以及生物進化和分類的研究。RFLP是根據不同品種（個體）基因組的限制性內切酶的酶切位點堿基發生突變，或酶切位點之間發生了堿基的插入、缺失，導致酶切片段大小發生了變化，這種變化可以通過特定探針雜交進行檢測，從而可比較不同品種（個體）的DNA水平的差異（即多態性），多個探針的比較可以確立生物的進化和分類關系。所用的探針為來源于同種或不同種基因組DNA的克隆，位于染色體的不同位點，從而可以作為一種分子標記(Mark)，構建分子圖譜。
當某個性狀（基因）與某個（些）分子標記協同分離時，表明這個性狀（基因）與分子標記連鎖。分子標記與性狀之間交換值的大小，即表示目標基因與分子標記之間的距離，從而可將基因定位于分子圖譜上。分子標記克隆在質粒上，可以繁殖及保存。不同限制性內切酶切割基因組DNA后，所切的片段類型不一樣，因此，限制性內切酶與分子標記組成不同組合進行研究。常用的限制性內切酶一般是HindⅢ，BamHⅠ,EcoRⅠ,EcoRV,XbaⅠ,而分子標記則有幾個甚至上千個。分子標記越多，則所構建的圖譜就越飽和。構建飽和圖譜是 RFLP 研究的主要目標之一。