青島能源所發布首臺“臨床單細胞拉曼耐藥性快檢儀”樣機

　　抗生素的濫用導致了細菌耐藥性蔓延這一“世紀危機”。為了推動全社會合理使用抗生素，世界衛生組織（WHO）自2015年以來將每年11月的第三周確定為“世界提高抗生素認識周（World Antibiotic Awareness Week, WAAW）”。在2018年WAAW來臨之際，中國科學院青島生物能源與過程研究所發布了自主研發的國內外首臺“臨床單細胞拉曼耐藥性快檢儀”（Clinical Antimicrobial Resistance Ramanometry； CAMR-R）。該系統通過重水標記單細胞拉曼光譜，不需細胞擴增而直接測量臨床病菌單細胞精度的耐藥表型，全流程可在三小時內完成。因此，CAMR-R為臨床合理使用抗生素提供了原創的解決方案。

　　抗生素的濫用導致細菌耐藥性蔓延、“超級病菌”頻發，以至于臨床感染在不遠的將來將“無藥可用”。因此，臨床上抗生素的合理使用是遏制耐藥性傳播的前提與關鍵，而前者則取決于臨床耐藥性快檢技術的突破。

　　長期以來，臨床上病原菌耐藥性檢測均基于“培養法”，其基本原理是，通過測量藥物對病原菌細胞的生長抑制程度，來評價其耐藥性。由于無法擺脫病菌的培養與純化過程，這些方法通常耗時長達24~48 小時，難以滿足臨床快檢現實需求，對于尚難培養或生長緩慢的病菌更是無能為力。核酸檢測及全基因組測序等分子診斷技術，只適用于已知耐藥基因的檢測，對于未知基因或機制造成的耐藥性則束手無策。而且它們僅能 “推斷”耐藥可能性，卻無法“定量”檢測耐藥性。而臨床上須基于“耐藥表型”進行“耐藥性確診”，以可靠地指導用藥。

　　在臨床需求與技術現狀矛盾日益突出的情勢下，開發基于原理創新的耐藥性快檢方法學已成為國際共性挑戰。例如，美國NIH 正懸賞二千萬美元激勵細菌耐藥性快檢技術開發，力求在2022年底前開發出臨床耐藥性快檢技術。

　　青島能源所單細胞中心前期發表了一系列論文，提出了“重水標記單細胞拉曼耐藥性快檢”與“單細胞拉曼藥物應激條形碼”的原理，引入了“最小代謝活性抑制濃度”（MIC-MA）的概念，發明了“單細胞光鑷微液滴拉曼分選”（RAGE）、“單細胞流式拉曼分選”（RAMS）和“單細胞微液滴流式拉曼分選”（RADS）等技術及其核心器件。基于這些方法學革新，單細胞中心研制成功首臺“臨床單細胞拉曼耐藥性快檢儀”原理樣機。

　　CAMR-R乃基于單細胞中心前期發明的重水拉曼組耐藥性快檢原理（D2O-Ramanometry）。當代謝活躍的細胞利用氘標記的水分子（重水）時，氘原子會參與細胞脂質合成過程，形成C-D 鍵并替換原有的C-H 鍵，且氘峰替換率（C-D Ratio）與細胞代謝活性線性相關。這一過程可通過單細胞拉曼光譜定量檢測。因此，通過比較抗生素處理下的單細胞拉曼光譜之C-D Ratio 變化，可以在單個細胞精度檢測抗生素作用下的代謝活性強弱，從而實現免培養的耐藥性快檢。由于所有的病原細胞維持生命活動都需要“喝水”，因此CAMR-R對于各種臨床病原菌具有廣譜的適用性。

　　迄今為止，MIC指數，即體外培養細菌24小時后能抑制培養基內病原菌生長的最低藥物濃度，一直是微生物藥敏試驗、抗菌藥效評價和臨床抗菌方案制定的主流標準與主要依據之一。然而其測量不僅耗時耗力，且對難以實驗室培養或生長緩慢的病菌無能為力。尤其關鍵的是，MIC只能從抑制細胞數目擴增這一角度反映與測量藥效，卻無法檢測處于“NGMA”（Non-Growing but Metabolically Active）狀態的病菌，即在藥物作用下已經不再增殖但仍然具備代謝活性的存活細胞。這種狀態的病菌在臨床上十分常見，如果在抗菌治療中成為漏網之魚，將貽誤病情，引起復發性感染，進而誘導耐藥菌乃至“超級細菌”的頻繁出現。因此根據MIC制定抗菌治療方案有可能出現“不夠快、不夠準、不夠狠”的情況。

　　為了克服MIC的核心缺陷，CAMR-R測量的是單細胞中心前期發表的“基于代謝活性的最低抑菌濃度”（“MIC-MA”指數）這一全新的抗菌藥效指標，即藥物作用后所有病菌細胞的代謝活性徹底被抑制的最低藥物劑量。由于無需細胞培養、而且能夠檢測“NGMA”狀態的病菌細胞，MIC-MA在實現“快、準、狠”的臨床抗生素用藥方面，與MIC相比，具有重要的特色與優勢。

　　CAMR-R搭載了自主研發的“臨床單細胞拉曼耐藥性分析”智能信息系統。耐藥性拉曼組自動采集軟件（CAMR-RamLIS）可快速、準確、智能化地獲取單細胞拉曼光譜信息。耐藥性拉曼組分析軟件（CAMR-RamEX）基于重水標記單細胞拉曼光譜，計算臨床樣品中病原細胞的耐藥性及其異質性。與此同時，耐藥性拉曼組數據庫（CAMR-RamDB）通過多層次/易擴展的臨床病原微生物單細胞拉曼數據庫及拉曼組搜索引擎，支撐自動化、高通量的病原微生物種類識別。在此基礎上，通過耦合獨創的RAGE分選模塊，快速分選出特定耐藥性表型的細胞，并對接下游的單細胞基因組測序，從而深入考察耐藥性的起源與傳播機制。

　　此外，CAMR-R還攜帶了三個主要試劑盒：單細胞拉曼耐藥性快檢試劑盒服務于臨床樣品重水飼喂和重水標記單細胞拉曼光譜的測量；拉曼光鑷液滴單細胞分選試劑盒包括RAGE芯片及其附件，用于特定耐藥性細胞的快速分選；單細胞全基因組擴增試劑盒則服務于分選后單細胞的裂解與核酸擴增，從而與單細胞測序對接。

　　CAMR-R在檢測原理、核心器件、分析軟件和儀器系統等環節均具有自主知識產權。目前，在國家重大科學儀器研制項目的支持下，單細胞中心正開發高通量、自動化的CAMR-R系統，并與國內外的醫療機構和工業界合作，設計與示范針對腸球菌、金黃色葡萄球菌、克雷伯氏菌、不動桿菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌、結核分枝桿菌等臨床主要威脅病原的耐藥快檢流程與醫學檢驗設施，服務于國內外首個“臨床單細胞耐藥性監測網絡”與“臨床單細胞耐藥性大數據系統”的建設。