Native-PAGE原理:
非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 (Native-PAGE)是在不加入SDS 疏基乙醇等變性劑的條件下, 對保持活性的蛋白質進行聚丙烯酰胺凝膠電泳,常用于同工酶的鑒定和提純.未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝膠電泳可以使生物大分子在電泳過程中保持其天然的形狀和電荷,它們的分離是依據其電泳遷移率的不同和凝膠的分子篩作用,因而可以得到較高的分辨率,尤其是在電泳分離后仍能保持蛋白質和酶等生物大分子的生物活性,對于生物大分子的鑒定有重要意義,其方法是在凝膠上進行兩份相同樣品的電泳,電泳后將凝膠切成兩半,一半用于活性染色,對某個特定的生物大分子進行鑒定,另一半用于所有樣品的染色,以分析樣品中各種生物大分子的種類和含量.
實驗方法:
非變性聚丙烯酰胺 凝膠和變性sds-page電泳在操作上基本上是相同的,只是非變性聚丙烯酰胺凝膠的配制和電泳緩沖液中不能含有變性劑如SDS等.
一般蛋白進行非變性凝膠電泳要先分清是堿性還是酸性蛋白.分離堿性蛋白時候,要利用低pH凝膠系統,分離酸性蛋白時候,要利用高pH凝膠系統.
酸性蛋白通常在非變性凝膠電泳中采用的pH是8.8的緩沖系統,蛋白會帶負電荷,蛋白會相陽極移動;而堿性蛋白通常電泳是在微酸性環境下進行,蛋白帶正電荷,這時候需要將陰極和陽極倒置才可以電泳分離酸性蛋白.
工作液配制:
1.40%膠貯液(Acr:Bis=29:1);
2.4×分離膠Buf(1.5 M Tris-HCl,pH 8.8):18.2 g Trisbase 溶于ml 水,用濃HCl調pH 8.8,加水定容到100ml,4℃貯存;
3. 4×堆積膠Buf(0.5 M Tris-HCl,pH 6.8):6g Trisbase 溶于80ml 水,用濃HCl調pH 6.8,加水定容到100ml,4℃貯存;
4.10×電泳Buf(pH8.8 Tris-Gly):30.3 g Trisbase, 144g 甘氨酸,加水定容到L,4℃貯存;
5.2×溴酚藍上樣Buf:1.25ml pH6.8, 0.5M Tris-Cl,3.0ml甘油,.2ml 0.5% 溴酚藍,5.5ml dH2O;-20℃貯存;
6. 10%APS;
7. 0.25%考馬斯亮藍染色液:Coomassie blue R-250 2.5g,甲醇ml,HAc 100ml, dH2O 450ml;
8.考馬斯亮藍脫色液:100ml甲醇,100冰醋酸,800ml dH2O
電泳膠的配制及電泳條件(上槽電極為負,下槽電極為正):
1. 堿性非變性膠 17%分離膠(10 ml) 4%堆積膠(5 ml)
2. 40%膠貯液(40%T,3.3%C) 4.25ml 0.5ml
3. 4×分離膠Buf(1.5 M Tris-HCl,pH 8.8)2.5ml
4. 4×堆積膠Buf(0.5 M Tris-HCl,pH 6.8) 1.25ml
5. 水 3.2ml
6. 10%APS 35ul
7. TEMED 15 ul
8. 10×電泳Buf(pH8.8 Tris-Gly):100ml稀釋到L
電泳條件:100V恒壓約20min,指示劑進入濃縮膠;改換160V恒壓,當指示劑移動到膠板底部時,停止電泳,整個過程約80min.
染色和脫色:取出膠板于0.25%考馬斯亮藍染色液中染色約30min,傾出染色液,加入考馬斯亮藍脫色液,緩慢搖動,注意更換脫色液,直至膠板干凈清晰背景.也可以用銀染或者活性染色.
分離堿性蛋白:
要用低pH凝膠系統,并使用以下緩沖液體系:
1. 分離膠:0.06M KOH,0.376M Ac,pH4.3(7.7% T,2.67% C);
2. 堆積膠:0.06M KOH,0.063M Ac,pH6.8(3.125% T,25% C);
3. 電泳緩沖液:0.14M 2-丙氨酸,0.35M Ac,pH4.5
將正負電極倒置,用甲基綠(0.002%)為示蹤劑
實驗操作同分離酸性蛋白.
回收:
native-PAGE結束以后,采用電泳的方法進行回收,方法如下:
電泳結束以后,切取部分染色,然后根據染色結果切取含有蛋白質的膠帶裝入處理過的透析袋中,加入適量的緩沖液,最后把透析袋放入普通的核酸電泳槽 中,并在電泳槽中加入適量的緩沖液(和透析袋中的緩沖液相同),低溫電泳2-3小時即可.回收蛋白所用的緩沖液一般和電泳所用的緩沖液相同.
SDS-PAGE和Native-PAGE的比較:
非變性凝膠電泳,也稱為天然凝膠電泳,與非變性凝膠電泳最大的區別就在于蛋白在電泳過程中和電泳后都不會變性.最主要的有以下幾點:
1. 凝膠的配置中非變性凝膠不能加入SDS,而變性凝膠的有SDS.
2. 電泳載樣緩沖液中非變性凝膠的不僅沒有SDS,也沒有巰基乙醇.
3. 在非變性凝膠中蛋白質的分離取決于它所帶的電荷以及分子大小,不像SDS-PAGE電泳中蛋白質分離只與其分子量有關.
4. 非變性凝膠電泳中,酸性蛋白和堿性蛋白的分離是完全不同的,不像SDS-PAGE中所有蛋白都朝正極泳動.非變性凝膠電泳中堿性蛋白通常是在微酸性環境下進行,蛋白帶正電荷,需要將陰極和陽極倒置才可以電泳.
5. 因為是非變性凝膠電泳,所有的電泳時候電流不能太大,以免電泳時產生的熱量太多導致蛋白變性,而且步驟都要在0-4度的條件下進行,這樣才可以保持蛋白質的活性,也可以降低蛋白質的水解作用.這點跟變性電泳也不一樣.
所以與SDS-PAGE電泳相比,非變性凝膠大大降低了蛋白質變性發生的機率
問題和解答:
1、非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳時預電泳是怎么回事的?預電泳時要加6×DNA上樣緩沖液嗎?電泳1-2小時再加結合反應產物嗎?
預電泳是除去凝膠中沒有聚合的單體和雙體和聚合引發劑,提高分辨率,不加任何物質,一般30-60分鐘后加樣電泳.
2、銀染的步驟是什么?銀染的關鍵因素是什么?
步驟是:
(1) 固定:10%冰乙酸min.
(2) 清洗:雙蒸水沖洗凝膠次,每次1min.
(3) 染色:染色液(1g硝酸銀,.5mL37%甲醛,1L雙蒸水.現配)染色30min.
(4) 清洗:迅速洗凝膠次.
(5) 顯影:30g碳酸鈉,1.5mL37%甲醛,200uL 10mg/L硫代硫酸鈉.顯影至清晰帶紋出現.
成功銀染的關鍵因素包括:
(6) 用超純水(比如,NANOpure或Milli-Q純化)或者是雙蒸水作銀染.
(7) 用提供的碳酸鈉或者ACS試劑級的碳酸鈉.
(8) 在染色后,水清洗所用時間的長短很重要,用不超過5-10秒的時間清洗膠,然后放入顯色溶液中,一般在水里浸一下就好.
(9) 甲醛和硫代硫酸鈉(ul/1ml)在使用前,及時加入到顯色液中.
(10) 在使用前及時配染色液.
3、變性PAGE的上樣緩沖液配方?如何準備上樣的蛋白?是將細胞用超聲破碎,還是用細胞裂解液,大多細胞裂解液中均含有SDS,不知有沒有用于非變性PAGE的裂解液.具有操作步驟是什么?
非變性的PAGE buffer就是0.5xTBE,上樣緩沖液可以用普通的loading buffer,含有Tris,溴芬蘭以及甘油即可,甘油是主要的沉淀作用成分.都可以自己配.細胞超聲即可,超聲后離心取上清.也有配NATIVE-PAGE gel所用buffer為1*TBE,用的running buffer也是1*TBE.還有一點就是要在配gel時考慮能使蛋白多聚體穩定的因素.
4、做了naive---PAGE沒有條帶,蛋白質是純品,分子量很大,怎么回事呢?
因為分子量很大,8%的膠濃度較合適.加樣時加個marker,可以檢測膠制備是否有問題.銀染方法比較靈敏,如果蛋白是一種酶,且可使某種底物顯色的話,可以用活性染色試試,更靈敏.
Native-PAGE注意幾個問題
1. 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的過程中,蛋白質的遷移率不僅和蛋白質的等電點有關,還和蛋白質的分子量以及分子形狀有關,其中蛋白質的等電點是最重要
的影響因子,要根據蛋白質的等電點來選擇對應的電泳緩沖系統;
2. 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的過程中,要注意電壓過高引起發熱而導致蛋白質變性,所以最好在電泳槽外面放置冰塊以降低溫度;
3. 蛋白質的分子量較大,則電泳時間可以適當延長,以使目的蛋白質有足夠的遷移率和其它的蛋白質分開,反之亦然;
4. 變性樣品的離子強度不能太高(I<0.1mM).調整樣品的PH在4.0左右,這對于能否做好非變性樣品非常重要.上樣BUFFER 中沒有SDS之外,加入樣品后不能加熱
