非損傷微測技術

實驗概要

本實驗利用非損傷微測技術對擬南芥的鈉鉀離子流進行了測定及數據分析。

實驗原理

非損傷微測技術起源于產生了眾多諾貝爾獎獲得者的美國MBL實驗室。非損傷微測技術離子選擇性微電極的工作原理：Ca² 離子選擇性微電極通過前端灌充液態離子交換劑(Liquid Ion Exchanger，LIX)實現選擇性。

該微電極在待測離子濃度梯度中以已知距離dx進行兩點測量，并分別獲得電壓V1和V2。兩點間的濃度差dc則可以從V1、V2及已知的該微電極的電壓/濃度校正曲線計算獲得。D是離子特異的擴散常數(單位：cm^-2.sec^-1)，將它們代入Fick第一擴散定律公式：J₀=-D.dc/dx，可獲得該離子的移動速率(picomol. cm^-2.sec^-1)即：每1s通過一個平方厘米的該離子/分子摩爾數(10-12級)。

實驗步驟

1. 非損傷微測技術測定離子流速的試劑配制

2. 離子流測定

K離子流測定：

   1) 將擬南芥種子鋪于正常和缺素的培養基上萌發；

   2) 先4℃成層處理3d，放置于22℃光照培養箱培養7d；

   3) 觀察測定野生型、突變體和超表達株系中的K離子流。

Na離子流測定：

   1) 將擬南芥種子鋪于MS培養基上萌發；

   2) 先4℃成層處理3d，放置于22℃光照培養箱培養7d；

   3) 然后轉移至含有200mM NaCl的MS培養基上處理4d。

   4) 觀察測定野生型、突變體和超表達株系中的Na離子流。

3. 數據處理

   1) 數據準備：從原始數據中找到Nernst Slope Nernst Intercept(選擇合適的校正的結果)；從原始數據中找到origin作為V₀，origin-X(或者是origin-Y，origin-Z)作為dv，新建EXCEL表格，復制V₀和dv到EXCEL共兩列數據，保存為.csv格式文件；

   2) 軟件登錄：進入網上Mageflux輸入網址http：//www.xuyue.net/mageflux/打開網頁，點擊圖標中START進入；輸入已創建好的名稱和密碼登錄；

   3) 添加項目：登錄之后，點擊Project Admin.進入項目管理界面；點擊添加一個新項目Add a New Project；

   4) 選擇參數：填寫Project  Name和Description，然后選擇電極測定的位置，即電極相對所測樣品的位置，為了操作的方便，一般電極在右邊。之后選擇坐標，一般都是原點減去X，Y，Z；最后選擇離子的參數，即所測的離子種類(Name  )，電極運動距離/采樣規則(dr)，選擇效率(eff)，擴散系數(D₀)，校正斜率(Slope)，校正截距(Intercept)。然后點擊Save Changes；

   5) 上傳文件：在左上角的Select a Project里選擇之前的項目名稱，點擊Go；進入該項，點擊上傳文件，即點擊Upload  New CSV File for Flux J Calculation；點擊瀏覽，把保存好的所要計算的.CSV上傳，點擊Submite the  File；

   6) 成功上傳：顯示文件已成功上傳，“點擊這里進行計算”，計算的數據便顯示在右邊欄；

   7) 打開數據：“點擊下載/在線查看剛剛生成的數據文件-J111.CSV"，打開或者保存文件；

   8) 數據顯示：最右邊的一欄即為已換算的流速，Flux J；

   9) 導出數據：把文件保存或者復制數據，用繪圖軟件做圖即可。