(二）外源 mRNA 在非洲爪蟾卵母細胞提取物中的翻譯
1) 室溫融化凍存的提取物，然后即置于冰上。
2) 同時，應將用于翻譯的 mRNA 分裝于 0.5 ml 或 1.5 ml 離心管中，置于冰上
3) 每 100ul 提取物應分別加入以下各成分：10ul 網織紅細胞裂解液 S-100,1ul120 mmol/L 精胺，2.5ul350mol/L 磷酸肌氨酸和 lO0ulCi[35S]-甲硫氨酸。按 10?50ul/管的量向盛有 mRNA 的離心管屮加入此種混合物，混合均勻后，置 21℃ 孵育 lh
4) 如果具有高放射件活性的體外合成 mRNA 被用于翻譯，則在反應結朿時應加入lOug/mlRNaseA 并置于 21°C 孵育 15 min，以除去由放射性 mRNA 帶來的將會妨礙進一步分析的放射性背景。
5) 如需儲存，反應可在此步通過冷凍加以終止
6）如用凝膠電泳分析或 TCA 沉淀反成，在加入等體積的 2XSDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳加樣緩沖液或篩選過濾前, 應向反應產物加入 1%X-100 和 lmmol/LPMSF
(三）翻譯產物的分析
對翻澤產物逬行普通的凝膠電泳常常可揭不其分泌表型：假如位爭肽序列被切割，則
分子質覽通常町減少 2k?3kDa; 如果發生糖基化，則產物的遷移宇通常比麥胚提取物或網織紅細胞裂解液翻譯產牛的末修飾的蛋白的遼移率有相對的降低。由于其他原因也對能導致遷移率改變，所以我們可以通過蛋 H 酶保護反說或者蔗糖密度梯度離心來確定
導致遷移率改變的真正原因=堿性蔗糖密度梯度離心能用于確定蛋白是否是否自由存在于內質網腔中或是整合十膜上，而特異的 N-糖基化的抑制可能表現為表面上的分子質量的增加。
1. 蛋白酶保護反應
1) 從轉錄反應體系屮取出 3X10ul 的反應液用于實驗，并置于冰上。假如必須使用少于 10ul 的反應液, 例如當產物要用于多種方法分析時. 可加入 4 倍體積的 1XT 緩沖液+10% 蔗糖對反應液進行稀釋。
2) 向毎個試管中加入 1ul 的 10％TrimnX-100 以裂解存在的膜，并提供一個蛋白質水解酶的陽性對照。
3) 在 10% 的蔗糖溶液屮加入 1ul1/ml 的蛋白酶 K 溶液并同時加人 Triton(二個樣品屮冇一個不添加，以作為加工過程中的穩定性對照）置于冰上 1 h
4) 用 3 倍體積的 10% 蔗糖溶液對 lOOmmol/LPMSF 進行稀釋: 按 1ul/反應的試加入 PMSF，使其終濃度達到 2?2.5 mmol/L，并繼續在冰上孵育 15 min。
5) 加入 lOOul2XSDS 聚丙烯酰胺凝膠屯泳加樣緩沖液其中包括 1%TntonX-100). 沸水浴 5 min, 如樣品在進行蛋白酶處沔前進行了稀釋，應加入更少體積的 2XSDS 聚丙烯酰胺凝膠屯泳加樣緩沖液，以使最終混合物中提取物的體積不少于 10%。
6)SDS 聚兩烯酰胺凝膠電泳分析 (其中包括-管來自同—反設體系的經相同稀釋的未作處理的樣品. 并將之作為標記物）。
2. 中性蔗糖密度梯度分離
蔗糖密度梯度分離不但可作為分析的工貝. 而旦能對樣品中的翻澤產物作活性分析前的純度分析。
假設按照如下所述的堿性蔗糖密度梯度分離，建議將反應的起始體積設為最少 50ul, 即這樣體積就更容易控制。
1) 于冰上用 10 倍體積的 1XT 緩沖液+10% 蔗糖溶液對樣品進行稀釋. 留一點樣品作為 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳的標記物，然后小心的將剩余的部分鋪于盛有 1 ml1XT緩沖液蔗糖溶液的 1.5 ml 離心管中。
2) 于 4℃、40000 g 離心 30 min。
3) 回收頂端包含細胞質蛋白的液層（10% 蔗糖溶液），操作時應避免此液層與 20% 蔗糖溶液層的互溶，以提高產物的純度。移出并棄余下的蔗糖緩沖液，小心不要觸動管底的呈褐色的膜珠。
4) 如果膜的穩定性對于蛋白酶保護反應或堿性蔗糖密度梯度分離等實驗是必需的，則首先用前述蔗糖密度梯度的一半體積的 1XT 緩沖液十 20% 的蔗糖溶液輕輕重懸膜珠，然后分別加入 TritonX-100 和 PMSF 至終濃度為 1%X-100 和 Immol/LPMSF，以溶解膜珠。
5) 通過 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳對總反應產物以及每一組分進行分析.
3. 堿性蔗糖密度梯度分離
堿性處珅可以破壞襄泡膜，釋放放囊泡內的蛋由，但并不溶解脂質雙分子層。在經蔗糖密度梯度分離后，囊泡蛋白將仍留在上清中，而膜結合的組分將以小珠的形式沉淀下來。
1) 取（三）翻譯產物的分析」中的 2 中的「中性蔗糖密度梯度分離」屮的第 4) 步所得的 1OOul 膜溶液，加人等體積的 200 mmol/LNa2C03，置冰上孵育 30 min。
2) 取上步所得的膜 250ul 的 Na2C03 溶液平鋪于盛有 lml20% 蔗糖溶液的 1.5 ml 離心管中，于 4℃ 以 100000 g 離心 1 h
3) 移出 100?150ul 上清，注意：此處允許小部分的損失，不要全部移出。去除 20%的蔗糖溶液后，用 1%TritonX-100,1 mmol/LPMSF 重新溶解膜珠。
4）在進行 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳分析前，應加入大約占總體積 10% 的 lmol/L 的HCL 以中和上淸液。注意：HC1 應緩緩加入，井不斷攪拌混勻，以防止局部的蛋白質變件沉淀。另外，在此過程中應不斷用 pH 試紙檢測溶液 pH, 以防 HC1 過量
4. 特異的 N-糖基化抑制
傳統上，位于多肽鏈上的 N-糖基化位點可通過能特異對其進行切割的內切糖苷酶 H 來測這里將介紹一種在策略下完全不同的新方法，通過加入競爭性的 Thr-Tyr-Asn'肽序列可以特異件的抑制非洲爪蟾提取物屮體外翻譯多肽的糖基化，以揭示所翻譯的多肽序列是否進行了 N-糖基化
1) 準備兩組濃度經系列稀釋的二肽水溶液，其濃度范圍為 1.5?50mol/L
2) 在冰上準備好-個至少 80UL 的休外翻譯反應系統，其中應包含用于翻譯成目的蛋白的 mRNTA。
3) 在每 9ul 翻譯反應液中加入 lul 的經系列濃度梯度稀釋的三肽溶液。另外，取一份 9ul 的翻譯反應液加入 1ulDMSO 以代替三肽溶液作為 DMSO 對應應影響的對照。將這些混合物 S 剩余的作為陽性對照的反應物共問于 21℃ 孵育 1 h。然后對樣品進行 SDS 聚內烯酰胺凝膠電泳分析，其中應包括一個經網織紅細胞裂解液翻譯的未糖基化蛋白作為標志物，從電泳結果中應可以看出，被特異抑制的糖基化的蛋比已經糖基化的蛋白泳動速度要快
注意事項
1) 與任何體外翻譯系統一樣，非洲爪蟾卵母細胞體外翻澤系統也應注意盡量避免其內含物具有 RNase 活性。
2) 不同的雌性爪蟾所排出的卵之間的質量是存在差別的，因此在使用前應對卵的活性進行檢測。檢測卵的受精能力是較為有效的方法。
3) 在極其偶然的情況下，一批卵可能不能很好的裂解。這種情況發生的顯著性標志是，在制備過程中經第一次離心后提取物不是呈琥珀色而是呈灰色. 這種提取物不能很好的進行體外翻評，因此應放棄不用
4) 如用于凍存，應將提取物按 l00ul//管或更少的量分裝到經冰預冷的離心管中，然后置于液氮中 1 min, 冷凍后，提取物最好存于液氮中，但如存于一 70℃ 也可保存其活件數月。
5) 如用凍苻的提取物進行翻譯反應，應避免進行如 T 操作：即在融化的提取物中加入所需的各種試劑. 然后將反應物一分為_并分別進行翻澤反應。因為經這樣操作后，提取物的濃度會被稀釋，這將大大影響其反應活性。
6) 不同的來源和批次的 RNNaseA 的純度是不冋的，因此每一批次使用前應進行滴定，以確定其最適使用濃度。RNNaseA 便用濃度一般為 0.1?5ug/ml, 濃度過低不能去除內源性 RNA 的干擾，而過高則會降解后加入的外源性 mRNA。
7) 在非洲爪蟾卵母細胞體外翻譯系統中，大多數來源于比作洲爪擔更高等的真核生物的 mRNA 時以得到很好的翻譯, 但是原核生物的 mRNA 卻不行。另外，天然的 mRNA 比體外合成的 mRNA 的翻譯效率要高.
8) 用于體外翻譯的 mRNA 的量在很大程度上取決于其來源與活性。通常，體外合成的 mRNA 的用量一般為約 50ug/ml，而poly(A)+mRNA 的用量為 100?200ug/ml, 這個用量并未超出提取物進行體外翻澤后修飾的能力。假如超出此用 1，則分泌性蛋白的有效分泌將會顯著下降，N-糖基化效率將會大幅度降低. 但是，即便使用非常高的 mRNA 的量，也未發現有信號肽末經剪切的情況出現
9) 提取物中的甲硫氨酸的含最大約是 35umol/L(±10%)，因此可以通過 TCA-沉淀反應的產物中 [35S]?甲硫氨酸所占的打分比來估計個反應的蛋白質產景。當用單克隆的 mRNA 進行反應時，產物屮甲硫氨酸的含 t 能被精確的計算得到；但當用 poly(A)1mRNA 時. 甲硫氨酸的含最一般被合砰的估計為 2%。如翻譯反應的￡3 標是盡町能多的獲得蛋白質時，那么我們可以通過添加過量的氨基酸以使蛋白的產量增加約體做法是：向提取物中加入約 5% 體積的包含 700umol/L 的甲硫氨酸和 2 mmol/L 的所有其他各種氨基酸。
10) 作體外翻譯反應中：[35S] 甲硫氨酸常常被使用，這不僅因為它來源方便，而且因為它在提取物中的含量較低，此可產生較好的信號. 但是，當目的蛋白質的甲硫氨酸含極低或是根本不含甲硫氨酸時，可用其他的氨基酸代替甲硫氨酸用于反應。但是，其前提是這些氨基酸要像甲硫氨酸一樣在非洲爪蟾卵母細胞中的含量有限，例如：半胱氨酸、亮氨酸、組氨酸和脯氨酸。
11) 最好在翻譯反應結東時就立即進行蔗糖密度梯度分離反應或蛋白酶保護反應
12) 在蛋白酶保護試驗中，一些信號肽位于胞質屮的穿膜蛋白會因為所添加的蛋白酶 K 的剪切作用而使肽鏈長度有所減少。