非程序DNA合成檢測實驗

細胞

EMEM羥基脲胰蛋白酶MNNG

以人二倍體成纖維細胞W1 38 為例

一、實驗組合
 

為證實被檢物作用的確切性，應做如下實驗組合安排

二、放射自顯影法UDS 的測定
 

1.  細胞培養

WI-38 成纖維細胞，完全培養液支持物蓋片培養法培養，細胞生長至匯合時；

2.  抑制DNA 合成

棄舊培養液，加入不含精氨酸的EMEM培養液，繼續培養20～24 小時；

3.  加測試物

加入10 mM羥基脲（陽性對照加MNNG），培養2 小時；

4.  H-TdR處理

2、3、4 每皿內加3H-TdR（5 μC/每皿）后，培養20～24 小時；

5.  漂洗

去除培養液，用不含鈣、鎂BSS漂洗；

6.  制片

制備放射自顯影標本方法（參考原位雜交基因定位法）固定細胞、涂膠、曝光、顯影及染色；

7.  觀察

在油鏡下計數，首先要排除S期半保留復制細胞（為銀粒密集覆蓋的細胞核），只計數核上的銀粒數目，再扣除本底（每例計數30～50 個細胞），結果以銀粒數/核的均值或含10 個銀粒左右細胞的百分率表示。

三、液閃計數法

1.  細胞培養和處理

人二倍體成纖維細胞：接種在培養皿中培養；

2.  加培養液、MNNG、羥基脲，以及3H-TdR處理等與前5項相同，自5漂洗后；

3.  消化

用0.25 %胰蛋白酶消化、制成懸液；

4.  液閃計數標本制備

10 %三氯醋酸處理，將細胞收集在玻璃纖維濾紙片上，無水乙醇脫水烤干、置液閃杯中、加閃爍液、置液閃計數儀上計數；結果以dpm/10⁶細胞或cpm/每皿細胞表示。

一、影響UDS的因素

1.  本底

與S期DNA合成不同，UDS的量很低，必須將本底控制在相當水平，才能顯示UDS。控制本底的關鍵是減少S期DNA合成；用缺精氨酸的Eagle液培養及羥基脲處理可達到此目的。

做上述處理后也仍有一定量的本底，其來源包括

（1）少數S期細胞的半保留復制；

（2）輕度的微生物污染；

（3）胞漿線粒體的DNA 合成；

（4）自然修復；

（5）3H-TdR非特異性附著；
 

（6）放射化學雜質；

（7）胸腺嘧啶催化物的重新利用。
 

為控制本底，除減少或消除上述因素的影響外，值得注意的是，羥基脲用量過大時也會抑制UDS，并有干擾待檢物的作用。因此，應根據不同細胞選擇羥基脲的濃度和作用時間，至少使已知陽性致癌物作用能在羥基脲抑制本底水嚴時顯示出來。

2.  藥物特性

不同致突變物對細胞作用方式不同，誘導DNA損傷的類型也不用。因此，不同藥物的用量及作用時間也不一樣。

例如，氮芥在10-4M 時，作用淋巴細胞2 小時就能誘發明顯的修復合成，而MNNG引起UDS的高峰卻是在作用后的12 小時。

檢測不同藥物，尤其環境致癌物時，應先作劑量反應曲線，選出最佳顯示UDS時間，還要考慮代謝活化作用，避免出現假陰性結果。

3.  細胞

當檢測實驗細胞的DNA 修復能力。用紫外線照射50 個細胞，結果以銀粒數/核的均值或含10 個銀粒左右細胞的百分率表示。用二倍體細胞進行實驗時，應先做核型分析。

一、UDS實驗需用適宜細胞，能表達UDS指示的理想細胞應該具有

1.  修復DNA 損傷能力；

2.  能代謝活化致癌物；

3.  間期細胞比例大，以及取材方便等性質。

但是，并非每種細胞都具備上述要求條件。

實際上隨細胞的不同各有利弊。常用以下幾類細胞

1.  原代培養大鼠肝細胞

具有代謝活化致癌物及修復DNA損傷能力，但S期細胞比例大，適合用放射自顯影法顯示UDS，不宜作液閃計數。

2.  人外周血淋巴細胞

處于靜止期細胞多為顯示UDS的有利條件，但做致癌物篩選時，存在個體之間的差異問題。

3.  人二倍體成纖維細胞

可用WI-38（ATCCCCL N075），能快速大量增殖，在細胞匯合成單層后，發生接觸抑制、細胞停止生長、DNA合成停止；用放射自顯影或液閃計數都能獲滿意的UDS效果，是比較理想的細胞，不足的是不能代謝活化致癌物。

二、結果評價
 

UDS反映致癌物對細胞的損傷和DNA修復，可用于檢測和篩選環境致癌物，有人檢測化學物的致癌性，結果證明靈敏度為68%，附合性為69.1%。因此UDS是快速、敏感篩選環境誘變和致癌物方法之一。UDS水平即DNA 修復性計算是以每次實驗10⁵細胞中實驗組和各對照組摻入3H-TdR dpm 之比。