非線性熒光損耗機理新進展

華南師范大學華南先進光電子研究院教授詹求強課題組在非線性熒光損耗機理及超分辨熒光顯微成像領域取得重要進展。相關研究5月23日在線發表于《自然—通訊》（Nature Communications）。

該研究在熒光損耗物理機理上，提出了受激輻射誘導激發損耗新機理，“拔本塞源”式對敏化能級進行損耗，從源頭阻斷熒光的激發能量，新機理帶來的“熒光損耗放大效應”大幅降低了超分辨所需要的激光光強，在低光強條件下實現了9種不同光譜探針的熒光損耗。

在超分辨成像技術上，由此發展了一種通用性強的基于單對低光強、近紅外、連續波激光的多色超分辨顯微成像技術，克服了傳統多色STED超分辨系統所依賴的多對超快脈沖光束協同工作的復雜系統、高成本、低穩定性等問題。

受激發射損耗（Stimulated emission depletion, STED）超分辨顯微鏡的概念由德國科學家Stefan W. Hell于1994年提出，該技術于2014年獲得了諾貝爾獎。然而，傳統STED顯微鏡存在原理性局限和問題：受激輻射作用如果要在與自發輻射（壽命有機染料通常為納秒級）競爭中占主導，通常需要高功率的超短脈沖（飛秒/皮秒）激光作為損耗激光，這往往會導致嚴重的光漂白、光毒性和重激發背景等問題。此外，多色STED超分辨技術和系統復雜度高、成本高、維護難。詹求強自2017年起帶領研究生探索新機理，最終以STED原理性缺陷為突破口，提出全新機理解決了關鍵問題。

上轉換熒光納米顆粒是一種納米熒光探針，具有近紅外激發、反斯托克斯位移大、無背景熒光、發光極其穩定等獨特優勢。上轉換納米探針通常是一個敏化-發光二元系統，敏化離子負責吸收激發光能量，然后傳遞給發光離子輻射波長更短的熒光。

為解決STED面臨的上述難題，詹求強課題組基于上轉換熒光技術提出了全新的思路：抑制敏化離子和發光離子間的能量傳遞過程就可以切斷對發光離子的能量補給，使得發光離子被“釜底抽薪”，即受激輻射誘導激發損耗（Stimulated-emission induced excitation depletion, STExD）機理。結合上轉換發光的多光子非線性泵浦依賴特性（非線性效應隨泵浦的光子數增多而不斷增強），實現了光子數越高的熒光能級電子損耗越強烈，STExD機理具有傳統STED所不具有的對熒光損耗進行非線性放大的獨特效應，與之伴隨的技術意義就是可以逐級降低高能級熒光損耗所需要的飽和光強，這突破了傳統STED中的飽和光強理論的限制（實驗測得值顯著低于傳統理論值）。

基于此，課題組使用740 nm的激發光和1064 nm的損耗光，在釹摻雜的上轉換熒光探針中實現了高達99.3%的超高損耗效率，損耗飽和光強降低至23.8 kW/cm2，比傳統STED探針降低了3個數量級。結合上轉換發光一對多的敏化-發光特性，STExD可以實現一對激光實現對多種UCNPs探針的光開關控制。釹離子是上轉換發光常用的敏化離子，可以單獨或與鐿離子聯合敏化多種發光離子，課題組利用鐿離子的能量傳遞橋梁作用，僅使用一組固定波長的激光器就成功實現了鉺離子，鈥離子的高效熒光損耗，損耗效率分別超過90%和80%。進一步地，也分別在鐠、銪、銩、鋱摻雜的體系中實現了高效的熒光損耗效應，總計實現9種不同光譜探針的同時熒光損耗。

以此新機理STExD為基礎，課題組發展了一種基于單對低光強、近紅外、連續波激光的多色超分辨顯微成像技術，分別對釹（黃色），鉺（紅色），鈥（綠色）摻雜的上轉換熒光探針實現了不同顏色的超分辨成像，原始圖像分辨率達34 nm，并進一步實現了釹、鈥摻雜的上轉換熒光雙色超分辨成像。通過熒光探針的表面改性和特異性修飾，課題組成功將上轉換熒光探針免疫標記到HeLa癌細胞的肌動蛋白纖維，實現了亞細胞結構的超分辨生物成像。該工作提出的STExD通用發光損耗策略巧妙地利用了上轉換熒光的傳能發光特性，為解決傳統STED技術的問題、開發新型探針提供了新的方案，為開發低光毒性、深層組織（近紅外II區損耗激光）的多色超分辨成像技術奠定了基礎，在突破衍射極限的光傳感、光遺傳學、光刻等前沿領域也具有廣泛的應用前景。

華南師范大學博士研究生郭鑫、蒲銳為該論文共同第一作者，來自瑞典皇家理工學院（KTH）的劉海春博士、Jerker Widengren教授等人以及詹求強課題組2016級黃冰如、2015級吳秋生等碩士生對該課題的完成做出了重要貢獻，詹求強教授為論文通訊作者，華南師范大學為論文第一完成單位。該研究得到了國家自然科學基金、廣東省自然科學基金等項目經費的支持。