革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復染等四個步驟，具體操作方法是：
（1）制片。
取菌種培養物常規涂片、干燥、固定。
要用活躍生長期的幼培養物作革蘭氏染色；涂片不宜過厚，以免脫色不完全造成假陽性；火焰固定不宜過熱（以玻片不燙手為宜）。
（2）初染。
滴加結晶紫（以剛好將菌膜覆蓋為宜）染色1-2min，水洗。
（3）媒染。
用碘液沖去殘水，并用碘液覆蓋約1min，水洗。
（4）脫色。
用濾紙吸去玻片上的殘水，將玻片傾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脫色，直至流出的乙醇無紫色時，立即水洗。
乙醇脫色是革蘭氏染色操作的關鍵環節：脫色不足，陰性菌被誤染成陽性菌；脫色過度，陽性菌被誤染成陰性菌。因而脫色時間一般為20-30s。
（5）復染。
用番紅液復染約2min，水洗。
（6）鏡檢。
干燥后，用油鏡觀察。菌體被染成藍紫色的是革蘭氏陽性菌，被染成紅色的為革蘭氏陰性菌。