靶向序列捕獲和新一代測序前對石蠟包埋組織及新鮮冷凍組織進行DNA質控
靶向序列捕獲和新一代測序前對福爾馬林固定石蠟包埋組織及新鮮冷凍組織進行 DNA 質量控制
作者
Melissa Huang Liu
安捷倫科技有限公司
美國加利福尼亞州拉霍亞
Maria Celeste Ramirez
安捷倫科技有限公司
美國加利福尼亞州圣克拉拉
摘要
本文將介紹利用 Agilent 2100 生物分析儀系統的微控流芯片電泳，在新一代測序工作流程的 SureSelect 靶向序列捕獲之前或期間，對福爾馬林固定石蠟包埋組織及新鮮冷凍組織的 DNA 樣品進行質量控制。借助 2100 生物分析儀系統可靠的 DNA 電泳技術，可提供彌散條帶譜及詳細的文庫統計信息，例如峰高、平均彌散條帶分子量、分子量分布和 DNA 濃度。FFPE DNA 樣品的結果與新鮮冷凍組織和對照 DNA 的 DNA 分析結果具有可比性。
前言
最常用的臨床樣品保存和存檔方法之一 是制備福爾馬林固定石蠟包埋 (FFPE) 組織。全世界的組織庫、醫院及實驗室內存檔的 FFPE 組織樣本數超過 4 億個。組織樣本通過解剖或活檢進行收集，然后用福 爾馬林固定以及石蠟包埋以保持其完整性， 用于組織病理學研究及顯微鏡觀察。收集到的這些病變組織和正常組織未來可能會成為分子遺傳學研究中非常有價值的資源。但是，從 FFPE 樣品中進行 DNA 提取面臨巨大的挑戰[1]。甲醛交聯、降解以及單鏈和雙鏈 DNA 相混合等常見問題會導致適合下游應用的 DNA 材料數量減少。因此，對用于新一代測序 (NGS) 等高靈敏度、成本高昂的應用的樣品進行質量評估顯得 尤為重要。
經驗證，2100 生物分析儀是 NGS 工作流程中進行片段 DNA 和 DNA 文庫分子量測定以及定量分析的一個重要工具[2]。本文將介紹利用 2100 生物分析儀的芯片電泳技術對 NGS 靶向序列捕獲工作流程中的FFPE 和新鮮冷凍 DNA 樣品進行分析。
實驗部分
材料
FFPE 及新鮮冷凍組織的 DNA 由西奈山醫學院捐贈（美國紐約州紐約市）， NA10831-1 對照 DNA 購自科里爾研究所（美國新澤西州卡姆登）。QIAmp DNA FFPE 組織試劑盒購自 QIAGEN GmbH（德國希爾登）。Ambion RecoverAll 總核酸分離試劑盒購自 Life Technologies 公司（美國加利福尼亞州卡爾斯巴德）。E220樣品前處理系統購自 Covaris 公司（美國馬薩諸塞州沃本）。2100 生物分析儀、安捷倫 DNA 1000 試劑盒，以及安捷倫高靈敏度 DNA 試劑盒均來自安捷倫科技有限公司（德國瓦爾特布隆）。
樣品前處理
采用 QIAGEN FFPE 組織試劑盒及 Ambion 核酸分離試劑盒提取病人 FFPE 腫瘤組織中的基因組 DNA。所有樣品均采用 SureSelect 靶向序列捕獲實驗方案進行進一步處理[3]。
采用芯片電泳進行 DNA 質量控制
DNA 電泳采用了 2100 生物分析儀，并根據生產商的實驗方案[4,5]，聯用 DNA 1000 試劑盒或高靈敏度 DNA 試劑盒。并在區域 (Region) 表格中對彌散條帶的濃度及平均分子量進行分析。峰高在色譜峰 (Peak) 表格中進行測定，如 SureSelect 實驗方案中所述[3]。
結果和討論
要想成功實現靶向序列捕獲和 NGS，關鍵是在樣品前處理工作流程中的特定時間點對樣品質量進行評估。在本文中，源自病人 FFPE 組織的基因組
DNA (gDNA)、新鮮冷凍腫瘤組織中相匹配的 gDNA，以及對照細胞系 DNA 均根據 SureSelect 實驗方案進行處理。利用
2100 生物分析儀在一些關鍵步驟進行 DNA 樣品質量控制(QC)：剪切后片段化、捕獲前擴增及捕獲后擴增（圖 1）。
圖1. SureSelect 靶向序列捕獲的樣品前處理工作流程。需要 DNA QC 的步驟以紅色框標識（A：剪切后，B：捕獲前擴增，C：捕獲后擴增）
剪切后片段化分析
源自 FFPE 樣品的 DNA 采用兩種不同的方法進行提取 — QIAGEN FFPE 組織試劑盒 (FFPE DNA Q) 和 Ambion
核酸分離試劑盒(FFPE DNA A)，并與相匹配的新鮮冷凍組織提取的 DNA 及對照 DNA 進行比較。所有樣品均采用 Covaris
系統進行片段化。剪切后樣品采用 DNA 1000 試劑盒分析(圖2），結果顯示各樣品均出現 100 至 450
堿基的彌散條帶。除了分子量及純度信息外，100 生物分析儀還可提供每個樣品的總 DNA 濃度，并對特定區域內的彌散條帶定量。
圖2. 剪切后的片段分布。使用 Agilent 2100 生物分析儀及安捷倫 DNA 1000 試劑盒分析樣品所得的膠圖及電泳疊加譜圖。樣品：FFPE DNA Q（紅色），FFPE DNA A（藍色），新鮮冷凍組織
DNA（綠色），對照 DNA（淺綠色）