食品中對羥基苯甲酸酯類的檢測—高效液相色譜法

　　摘要：文章采用超聲提取-高效液相色譜法同時測定食品中3種對羥基苯甲酸酯（對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯）含量的方法。對羥基苯甲酸酯類屬于防腐劑，按GB/T5009.31-2003國家推薦方法檢測[1]，樣品提取比較繁瑣、費時，且回收效果欠佳。本文利用較為常見的紫外檢測器通過優化條件，摸索出一個簡捷、快速、經濟、靈敏，又能保證一定精度的測定方法。本方法加標回收率在86.08%～112.71%之間，線性系數R>0.9998，檢出限可達0.10ug/ml，分析時間短，完全能夠滿足分析要求，可廣泛應用于食品中對羥基苯甲酸酯類檢測分析。
　　1 實驗部分
　　1.1 儀器和試劑
　　1.1.1 儀器 Shimadzu Lc 10vp plus高效液相色譜系統（日本Shimadzu公司），配紫外檢測器及Lc solution色譜工作站；分析天平：感量0.1mg；氮吹儀：美國Organomation N-EVAP112型；均質機：IKAR werke T25型均質機；溶劑過濾裝置；0.45μm和0.22μm過濾膜和過濾頭；Milli-Q超純水機。
　　1.1.2 試劑 甲醇、乙腈為HPLC級；乙醇為分析純；水為超純水。
　　標準品：對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯，純度為99.0%，美國進口，購于上海安譜。
　　1.2 標準溶液的配制[2]
　　標準貯備液：精密稱取三種標準物質0.05g，用無水乙醇溶解并定容于50mL容量瓶中，配制成濃度為1mg/mL的標準貯備液，貯于4℃冰箱中備用。
　　標準使用液：用刻度吸管準確吸取三種標準貯備液，根據需要用無水乙醇配制成不同濃度的標準溶液系列，待用。
　　1.3 色譜條件
　　色譜柱：Diamonsil C18，粒度5μm，4.6mm×250mm（ID×L）；檢測波長：254nm；流速：1.0mL/min；進樣量：20 μL；流動相：水-乙腈（體積比為45：55）；柱溫：室溫。
　　1.4 實驗方法
　　1.4.1 樣品準備和處理 稱取樣品5g（精確至0.01g），置于50mL比色管中，加入25mL無水乙醇，置超聲波水浴中提取10min，取出，4000rpm離心10min，上清液轉入容量瓶中，殘留物再用25mL無水乙醇重復提取1次，合并上清液，用無水乙醇定容至50.0mL，靜止，上清液經微孔濾膜（4.5μm）過濾作為試液，供高效液相色譜儀測定。
　　1.4.2 樣品分析 在相同色譜條件下，將標準工作液按照濃度由低到高的順序進樣測定，以各組分的峰面積對其濃度繪制標準曲線。待測液在于標準曲線進樣相同的條件下進樣分析，以保留時間定性，峰面積外標法定量。
　　2 結果與討論[3]
　　2.1 提取溶劑的確定
　　對羥基苯甲酸酯類難溶于水，易溶于甲醇、乙醇等有機溶劑。分別選用乙醇、甲醇作為提取溶劑進行回收率試驗。試驗結果表明，甲醇和乙醇均具有較高的提取效率，無明顯差異。由于甲醇揮發后易被呼吸道、胃腸道和皮膚吸收而致中毒，對長期接觸的實驗人員具有一定的傷害，而乙醇毒性較小，因此本試驗中采用乙醇作為提取溶劑。
　　2.2 流動相的選擇
　　為選擇最佳的流動相，分別用乙腈-水、甲醇-水和甲醇-乙酸銨溶液三種流動相體系進行了試驗。由于此儀器為單泵系統，無法采用梯度而只能采用等度的流動相配比。結果顯示，使用甲醇-水流動相的分離度不是很好；甲醇-乙酸銨溶液分離較好，但由于溶液中含有鹽類，用久了會對柱子壽命有一定影響；乙腈-水流動相體系，分離度較好，且配制簡單，對柱子無不良影響。此外，還考察了不同體積分數的乙腈-水對各組分分離的影響。結果顯示，乙醇體積分數為55%時流動相最為適合，分離效果好，色譜峰明顯，而且保留時間合適。
　　2.3 檢測波長的選擇
　　用紫外檢測器分別在254、248nm波長處對各組分的標準溶液進行檢測，發現3種組分在254nm處紫外吸收較強，靈敏度較高，因此本實驗優先選擇254nm作為該實驗的檢測波長。
　　2.4 方法的評價
　　對羥基苯甲酸酯類的混合標準工作液均用乙醇稀釋并定容，三種對羥基苯甲酸酯類標準溶液濃度系列為0.008mg/L、0.04mg/L、0.4mg/L和4.0mg/L。對羥基苯甲酸酯類標準品通過高效液相色譜進行分析，檢測結果如圖1所示。實驗結果表明，在乙腈-水（55：45）為流動相條件下，各組分保留時間合適，而且分離效果較好。圖1為三種對羥基苯甲酸酯類四種標準系列的標準品的高效液相色譜圖。
　　圖1 三種對羥基苯甲酸酯類四種濃度標準品的高效液相色譜圖
　　峰1.對羥基苯甲酸甲酯（尼泊金甲酯）；峰2.對羥基苯甲酸乙酯（尼泊金乙酯）
　　峰3.對羥基苯甲酸丙酯（尼泊金丙酯）
　　表1為三種對羥基苯甲酸酯類不同濃度進樣時保留時間的變化及峰面積變化表，保留時間的RSD%分別為0.260、0.241、0.204。
　　圖2為三種對羥基苯甲酸酯類濃度為0.008mg/L時進樣時的出峰狀況。峰形明顯，可以作為判定依據。
　　2.5 加標回收率
　　向5份樣品中分別加入不同量的對羥基苯甲酸甲酯標準溶液，按本法處理、測定并計算回收率，結果見表2。
　　2.6 檢出限
　　本方法檢出限0.10μg/mL。
　　2.7 優點
　　樣品前處理簡單，省時省力；液相分析也無需使用梯度，等度淋洗即可，對液相系統沒有嚴格要求，一般單位均能承受。
　　3 結論
　　實驗表明，本方法所用乙腈-水流動相，對分析柱的損害較小；樣品加標回收率在86.00%～109.50%之間；線性系數R>0.9998；三種對羥基苯甲酸酯類檢出限均可達到0.10μg/mL，能夠滿足一般食品等樣品中對羥基苯甲酸酯類殘留量的分析要求。另外本方法具有簡便快速、準確靈敏、成本低、可靠性強等優點，應用前景廣泛。
　　通訊作者：修麗華，女，長春市產品質量監督檢驗院正高級工程師，從事食品檢測技術研究和新方法開發工作。