Rf(比移值)=斑點移動距離/溶劑前沿距離
所使用的展開劑有：
1)正丁醇︰無水乙醇︰1%氨水 = 6︰2︰3
2)正丁醇︰吡啶︰1%氨水 = 6︰3︰4
3)異丁醇︰無水乙醇︰水 = 3︰2︰2
⑼ 提純色素溶液的薄層分離和定量
經過紙層析定性之后，含有一種色素的樣液定容之后，離心即可定量;含有兩種以上的復合色素的樣品溶液，需要經過薄層分離為單色素后，再用比色法分別定量，測定出各種色素的含量。
具體步驟是：薄層板制板→點樣層析→比色→標準曲線繪制→計算含量
1) 薄層板制備
聚酰胺粉1g于研缽中→加15ml 75%甲酸→攪拌，使聚酰胺全部溶解→加7.5g硅膠G→研磨1分鐘→立即涂板(玻璃板要求光滑平整，先用水洗凈，干燥后用酒精擦拭干凈，涂板時可用涂本器或手工玻璃涂布)→可涂15×10厘米玻璃板三塊(厚度為0.25-0.3毫米)→玻璃板放入盛有少量水的大玻璃缸中→蓋好蓋子→使玻璃板中的甲酸由缸底的水吸取→放2-3小時→取出玻璃板→于空氣中風干→于60-65℃烘箱30分鐘→放入干燥器中備用
2) 點樣層析
用點樣管(毛細管、微量注射器)將濃縮并定容的樣液點在薄層板上→基線距底邊2厘米→點成與底邊平行的條狀→兩端距邊各為2厘米，點樣量一般為0.4ml→點樣時要用電吹風機邊點邊吹干→然后進行展層析
展層缸先用溶劑系流30分鐘→再把點好樣的薄層板放入展析缸用上行法展開→薄板下端浸入溶液0.5-1厘米→大約1小時看色素已明顯分開后→即可取出薄板→晾干
對溶劑系流的選擇是：a) 分離胭脂紅、莧菜紅、新紅、檸檬黃、桔黃、靛藍等用正丁醇︰吡啶︰5%氨水=6︰6︰4(這種展開劑主要分離靛藍，因為靛藍上升很快，其它上升很慢);b) 分離檸檬黃、胭脂紅、莧菜紅、檸檬黃、桔黃等時用展開劑為2.5%檸檬酸鈉︰氨水=4︰3(檸檬黃上升很快，其它上升慢);c) 對于分離兩種紅色素(莧菜紅、胭脂紅)的食品用甲醇︰乙二胺︰氨水=10︰3︰4(主要是莧菜紅與胭脂紅上升快，其它色素上升慢)。
3) 比色定量
將薄層板展開后→用小刀分別將各條色斑刮下→移入砂芯漏斗→用乙醇氨溶液解吸抽濾→于水浴上蒸發到無氨味→定容10ml→分別測出消光值E(根據各種色素的最大吸收波長測定其光密度)→從標準曲線上查出相應的各色素含量.
4) 標準曲線的制備
先配成標準色素貯備液(100微克/ml)，稱0.1g標準色素加水稀釋至1000ml
10ml比色管 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
標準應用液 0 0.1 0.5 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0
加水 分別加水至10ml
相當于μg/ml 0 1 5 10 20 30 40 50 60 70
分別測出EO-E9的消光值以水為參比，以色素濃度為橫生標，消光值為縱坐標，繪制標準曲線。以水為參比，pH值為6，各色素的最大吸收波長為下：
胭脂紅 508納米;檸檬黃 428納米;莧菜紅 520納米;
晚霞黃 485納米;赤蘚紅 528納米;靛藍 610納米;
注意事項
1) 上述兩個公式若乘以1/100，即由mg/㎏變為幾/萬。例如胭脂紅含量為80mg/㎏即0.8/萬;2) 聚酰胺粉吸附要求預先活化，并要求在一定的溫度、pH和一定的作用時間下進行，操作時要注意。聚酰胺在酸性條件下吸附色素牢固，用水洗滌聚酰胺粉以除去可溶性物質，要求水偏酸性(pH=4)，防止聚酰胺上色素在洗滌過程中脫落下來;
3)樣品的前處理和提純過程很重要，要充分去除雜質(油脂、蛋白質、淀粉、糖)以免影響吸附及層析效果。
一般能溶解在水中的物質，如食鹽、糖、味精、香精等，在用酸性水洗滌聚酰胺粉時都能除去，還有明膠、果膠也可以通過大量水除去;對油脂類可以用丙酮或石油醚洗滌脫脂，如果油脂含量很高，可在研缽中用丙酮、海砂研磨除去;對于樣品中蛋白質、淀粉含量高時，可用蛋白酶或鎢酸鈉、淀粉酶水解后除去;對于天然色素可用6︰4甲醇-甲酸除去;
4) 紙層析定性時不可皺折，邊緣應剪齊，不可有毛邊，而且要注意紙的橫、豎向，應順紋上行，展開較好，否則結果不規律;
5) 在濃縮樣液時應控制水浴溫度70-80℃，應使緩慢蒸發，勿濺出皿外，防止色素干結在蒸發皿的壁上(應經常搖動蒸發皿);
6) 靛藍褪色由深蘭色→淺蘭色→黃色→無色。靛藍褪色是由于光、氧、溫度高、PH等多種因素的影響，測定靛藍時要注意上述因素的影響;
7) 展開劑使用時最好2天換一次，以保證分離效果，放置時間過長造成濃度和極性都起變化，影響分離效果;
8)漏斗用完后要洗凈，先用濃HCl20ml少量多次洗，然后用水多次沖洗，否則影響下一個樣品的吸附或解吸作用;
9) 聚酰胺粉可回收使用。使用過的聚酰胺收集于干凈的燒杯中，用0.5%NaOH溶液浸泡24小時之后水泵抽干，倒回燒杯，加0.1N HCl泡30分鐘，然后再用水泵抽干，用水洗至中性，置60℃烘箱烘干備用;
10) 比色時樣液要求清晰，若混濁使E增大，影響結果，如果混濁可離心也可放置。