食蟹猴胚胎3D長時程體外培養模型

　　2023年5月11日，中國科學院動物研究所/北京干細胞與再生醫學研究院和美國賓夕法尼亞大學的研究人員在《細胞》雜志在線發表封面文章。他們建立了一個可支持食蟹猴胚胎體外發育至受精后25天的3D長時程培養體系，并基于該體系探究了靈長類胚胎中晚期原腸運動和早期神經發育過程中的核心事件和譜系特征。

　　世界上每30秒鐘就會有一名缺陷兒出生，出生缺陷是嬰兒死亡的首位原因。出生缺陷與早期胚胎發育異常密切相關。因此研究早期胚胎發育過程、探究發育機理，對從根源上提高人民健康水平至關重要。

　　但人類早期胚胎極難獲取，因此科學家們無法直接在體探究人類胚胎發育過程和機理。胚胎體外培養技術是可視化研究胚胎發育過程的有力工具。借助人類胚胎體外培養技術，胚胎期第14天之前的發育事件已被初步揭示。然而，由于科研倫理限制，人類胚胎研究遵循“14天原則”，即人類胚胎體外研究必須在第14天終止。因此體外培養的人類胚胎不能被用于研究胚胎期14天之后發生的原腸運動和早期神經胚發育等事件。

　　為此科學家一直致力于搭建非人靈長類胚胎體外培養體系。1995年，澳大利亞科學家將絨猴的囊胚體外培養至胚胎期11天；2019年，王紅梅團隊及國內外同行將食蟹猴胚胎體外培養至胚胎期20天。但要探究靈長類胚胎中晚期原腸運動和早期神經胚發育，還需要進一步延長食蟹猴胚胎的體外發育歷程。

　　在本研究中，研究者首先嘗試構建可延長食蟹猴胚胎體外發育時程的培養體系。他們首先比較了2D與3D培養體系，發現2D和3D培養體系都能支持胚胎發育到第20天。在2D體系下，胚胎由于胚外組織發育旺盛而迅速增大，但內部的胚體發育并不好；而在3D體系下，胚胎的胚外組織生長受限，但胚體結構顯著發育。為了保證胚體發育，研究者繼續優化3D體系，并建立了3D長時程培養體系（prolonged in vitro culture，pIVC；圖1），該體系能支持33.7%的食蟹猴胚胎發育到胚胎期25天。

　　圖1. 能夠支持食蟹猴胚胎體外發育至25天的3D長時程培養體系

　　利用此體系，研究者進一步探究靈長類早期神經胚發育過程。研究者對神經系統發育關鍵調控因子進行鑒定，發現pIVC胚胎的神經管形態和多種分子表達特征與體內相同發育階段的胚胎相似（圖2）。伴隨神經外胚層的發育，pIVC胚胎的表皮和神經板邊緣的發育同步進行。更重要的是，pIVC胚胎可重現神經管沿背腹軸區域化發育的模式，并分化出早期運動神經元祖細胞（圖3）。

　　圖2. pIVC胚胎神經外胚層和神經嵴的特化

　　此外，研究者還檢測了pIVC胚胎中原始生殖細胞和中、內胚層的發育特征。結果提示與相同發育階段的體內正常胚胎相比，pIVC胚胎的分子表達特征與正常胚胎相似，表明pIVC胚胎可重現原腸運動中晚期階段中胚層和內胚層的發育。

　　圖3. pIVC胚胎神經管細胞的特化

　　最后研究者進一步利用單細胞多組學測序技術，對9個pIVC胚胎的單細胞的轉錄組、DNA甲基化和染色質可及性進行測序和分析。結果提示，與本團隊2022年在《自然》雜志報道的相同發育階段的食蟹猴胚胎單細胞轉錄組數據庫相比，pIVC胚胎可重現體內正常胚胎的轉錄組特征，并且各種細胞類型的基因均發生了甲基化，胚胎組織的DNA甲基化水平高于胚外組織，與已報道的小鼠和人類胚胎特征相似。

　　本研究在已有體內研究的基礎上進一步填補了靈長類胚胎中晚期原腸運動至早期器官發育階段的領域空白，為靈長類胚胎體外培養和基于干細胞構建的“類胚胎”的體外培養提供了參考體系，為深入了解人類早期胚胎發育機制，以及早期胚胎發育異常相關疾病的病理研究提供了技術平臺。

　　中國科學院動物研究所副研究員翟晶磊、博士研究生徐艷紅、助理研究員萬海峰、博士研究生燕蕊、博士研究生郭敬以及美國賓夕法尼亞大學博士后Robin Skory為本文共同第一作者。中國科學院動物研究所/北京干細胞與再生醫學研究院王紅梅研究員、郭帆研究員、李偉研究員和美國賓夕法尼亞大學Nicolas Plachta教授為本文共同通訊作者。

　　 https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.04.019