在對骨骼生理和病理的研究過程中，經常需要制備脫鈣的骨免疫組化標本，然而由于骨骼組織的特殊性，制備好的骨組化標本也并不是一件容易的事。由于骨組織中60%以上為鈣鹽組成的羥基磷灰石結晶，脫鈣是標本制備中至關重要的過程。一些強酸如鹽酸，硝酸等雖能快速有效除去骨組織中鈣鹽，但對其中的抗原蛋白也產生了致命性破壞，使接下來的工作無法進行；這里介紹一種由袁永輝建立的EDTA低溫脫鈣法，可滿足骨組織免疫組化染色的要求。
1.組織處理：取材骨組織投入到4%多聚甲醛中，4℃固定24~48小時。
2.脫鈣處理：投入15% EDTA-2Na于4℃冰箱脫鈣3周，每周換1次脫鈣液，以細針刺人為脫鈣終點。
3.后續操作：取出蒸餾水沖洗→梯度濃度乙醇脫水→石蠟包埋→切片→4μmSP法常規免疫組化染色。
4.結果判定：經EDTA低溫脫鈣后骨小梁結構保存完整，細胞因子IGF-1在骨細胞、成骨細胞及骨髓基質細胞胞質中都有表達，呈黃色絲狀分布。
5.注意事項：
（1)固定劑宜選用甲醛或多聚甲醛，低溫24小時以上。
（2)脫鈣盡可能用最短的時間達到最佳的脫鈣效果，但不能使用強酸。
（3)骨切片在4μm左右為佳，太厚也易造成脫片，太薄則骨結構難以完整顯現。
（4)骨標本不宜高壓修復，可直接行免疫組化染色。
（5)選用中性EDTA脫鈣液，該液對組織形態結構和抗原都保存較好，而不能用強酸脫鈣，脫鈣溫度最好在4℃冰箱內進行。
（6)脫鈣程度以大頭針能刺入脫鈣骨組織而沒有阻力為止。