骨髓基質來源的間充質干／祖細胞培養基本原則和鑒定

(a)去除抗凝管蓋子，將骨髓液轉移至50mL離心管中。加人室溫的HBSS,確保體積達到25 mL。

(b)取另一個50 mL離心管，加人20 mL Ficoll-Paque淋巴細胞分離液，將25 mL細胞懸液輕輕加到Ficoll上層。HBSS與Ficoll間的界面不能被破壞。

(c)關閉閘，室溫1800g離心30min。

(d)離心完畢，于Ficoll和HBSS的界面收集白色細胞層,將其移至新的50 mL離心管中。

(e)用HBSS將收集到的細胞懸液體積調至3倍，室溫1000g離心10 min。重復洗滌。

(f)用30 mL預熱至37℃的CCM重懸細胞

(g)取10μL細胞懸液加入到10μL臺盼藍中，血細胞計數器評價細胞的存活率，存活率需高于80%。

(h)將30mL細胞懸液移至直徑15 cm組織培養皿中，于5% C0₂培養箱中培養至少15h。

(i)從培養箱中取出培養皿，吸出培養基。

(j)加入20 mL預熱的PBSA,潤洗單層細胞，棄去。

(k)重復潤洗過程3次。

(l)加人30 mL預熱的新鮮CCM。

(m)每隔一天重復此潤洗和更換培養基操作，共6天。

(n)6天后，在倒置顯微鏡下觀察單層細胞，貼壁的、成纖維細胞樣MSCs克隆在培養皿中清晰可見。有時可能有造血細胞污染的跡象，但這些細胞可以在傳代時被去除。培養物達到50%?60%匯合時，進行擴增和凍存處理。

完全培養基（CCM)：α-MEM: α低限量基礎培養基 含谷氨酰胺 無核苛酸或脫氧核苷酸；添加：附加L-谷氨酰胺2 mmol/L(終濃度 包含組分內的谷氨酰胺共4 mmol/L)，20%經FBS雜交瘤純化 非熱滅活，青霉素100 U/mL，鏈霉素100μg/mL。過濾除菌 儲存于4℃ 不超過2周。