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  • 發布時間:2020-06-16 15:58 原文鏈接: 高內涵成像技術在單抗結合檢測中的應用(一)

    優點   1.無需沖洗的檢測方法提高效率,減小浪費   2.應用范圍廣,可用于貼壁細胞,懸浮細胞及免疫磁珠   3.可用任何波長的熒光標記   4.高敏感度可檢測低豐度抗原   單抗結合檢測方法的發展大大提高了細胞及免疫磁珠的高通量,高內涵分析效率。這種不用沖洗,基于熒光微孔分析技術(fluorometric  microvolume assay technology,  FMAT)的方法可以快速的針對更少量的細胞進行篩選,而且在傳統樣本檢測中由于多次洗板造成的細胞損失也完全可以避免。   抗體的發現在診斷疾病,研發疫苗和治療疾病的過程中起到重要作用。研究者們利用雜交瘤細胞或者形成克隆來篩選高表達克隆株,檢測細胞表面的抗體結合效率,觀測抗體或配體在細胞內的內化。在傳統的FMAT檢測方法的已有優點之上,利用ImageXpress?  Micro  寬場高內涵分析系統進行操作的單抗結合檢測方法可以讓科學家們在同一個平板孔中檢測多種不同細胞的表面抗體結合情況。這一系統也可以將檢測規模提升到1536孔板,并且只需要2-3微升的樣本。即使用更低的二抗濃度,其檢測范圍和靈敏度也不會下降,甚至有所提高。   檢測原理    抗體被富集在磁珠上并用帶熒光的二抗進行標記。熒光成像技術可以檢測被磁珠捕獲的抗體數量。利用類似的方法同樣可以檢測細胞表面結合的配體以及配體和抗體的內化。   在單抗結合檢測過程中(圖1),應將貼壁細胞,懸浮細胞或抗體包被磁珠樣本加入到96,384,1536孔板中。然后加入一抗(目標抗體),接著用二抗對一抗進行標記來檢測一抗的結合情況。                        所有的檢測試劑加到微孔板后都無需沖洗。細胞或抗體包被的免疫磁珠被固定在孔板底部表面,即使孔板底部有高背景熒光,陽性信號也可被識別并分析。    線性和檢測范圍   在第一個實驗中,我們將不同濃度的一抗滴定使之與7微米的磁珠結合。加入被分析物,用二抗標記并利用ImageXpress Micro 高內涵分析系統成像。傳統的FMAT檢測方法只能利用紅色(Cy5)通道進行檢測,而ImageXpress Micro系統可以捕捉到多種波長圖像,所以任何二抗標簽都可以用來標記及檢測。在這個滴定實驗中,二抗是用DyLight 488標記的。   MetaXpress? 高內涵圖像采集和分析軟件中應用Count Nuclei  模塊對圖像進行分析,所得出的最低檢測閾值(LLD)為0.5ng/ml(30pg/well),線性響應大概在1-31ng/ml。此次一抗滴定實驗的曲線顯示出了“前帶現象(prozone)”,以及與單抗結合檢測相關的“鉤狀現象(hook  effect)”。在曲線頂峰的信號衰減是由于未結合的一抗在介質中與二抗結合,使之未能與細胞和磁珠結合所致(圖2)。                              免疫磁珠的一抗結合曲線見上圖。12.7微米包被羊抗小鼠抗體的磁珠被結合到不同濃度的小鼠lgG抗體上,并加到微孔板中,在孔板中與標記AlexaFluor488的二抗室溫下共孵育1-2個小時,實驗設四個復孔及同型抗體對照孔。圖像為10X  PlanFluor物鏡拍攝。孔板的縮略圖(下)清晰的顯示出抗體結合的濃度梯度。分析結果:LLD 為0.5 ng/mL (30  pg/well),在1-31ng/mL之間呈線性關系。

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