高分辨率熔解曲線方法檢測不同的DNA雜合體
文章來源：Clinical Chemistry 51, No. 7, 2005
Distinguishing Different DNA Heterozygotes by High-Resolution Melting, Robert Graham,1 Michael Liew,2 Cindy Meadows,2 Elaine Lyon,2 and Carl T. Wittwer1,2* (1 Department of Pathology, University of Utah School of Medicine, Salt Lake City, UT; 2 Institute for Clinical and Experimental Pathology, ARUP, Salt Lake City UT; * address correspondence to this author at: Department of Pathology, University of Utah School of Medicine, Salt Lake City, UT 84132; fax 801-581-4517, e-mail carl.wittwer@ path.utah.edu)
最近，高分辨率熔解曲線法（High-resolution melting）作為一種可以在小的擴增子中來檢測單核苷酸多態性基因型的技術被引進。這種基于封閉小管子的方法（包括快循環的PCR）可以在15分鐘內完成，并且不需要采用熒光定量PCR儀、等位基因特異性PCR和熒光標記的寡聚核苷酸。該過程通過采用可以檢測異源雙鏈DNA的染料得以實現，這種染料在飽和的程度下也不會抑制PCR反應。野生型和純合子的樣品可以通過熔解溫度( Tm)的遷移來區別。雜合子樣品和純合子樣品可以通過被改變的曲線形狀來更好的區分，而不是通過熔解溫度。雜合子樣品可以產生溶解溫度較同源雙鏈更低的異源雙鏈。雜合子產生的被放大的熔解曲線包括2個同源雙鏈和2個異源雙鏈，會產生一個傾斜的復合的熔解曲線。這種熔解曲線在形狀上可以很容易與純合子的曲線加以區別。
然而，在一個擴增子中不同的雜合子是否可以通過不同曲線的形狀被區分出來還不太清楚。根據擴增后產生的同源和異源雙鏈的情況，可以將SNPs分為四種類別。不同類別的SNPs異源雙鏈的錯配是不同的，因此，如果儀器的分辨率足夠有效的話，它們的熔解曲線是可以被區別的。并且，在同種類別中，不同的雜合子也是可以被區別出來。盡管這種錯配是相同的，但是最相近的參數穩定性卻依賴于相鄰堿基的錯配，因此，預測出來的穩定性常常是不同的。
我們從ARUP實驗室中選取用來做標準臨床基因型鑒定的HFE, V Leiden因子和II型多態因子的DNA樣品，采用MagNa Pure instrument (Roche)的方法來抽提DNA，采用基于LightCycler的鄰近雜交探針[adjacent hybridization probe(HybProbeTM)]的方法來確定基因型。采用探針融合分析基因型的一個優點就是可以用探針鑒定出除了預期改變的序列以為的改變。在ARUP實驗室中進行常規的臨床分析時，一旦在意外的溫度下出現了異常的熔解峰時，樣品就會通過進一步的測序來確定序列的改變。在預計的突變附近的一些雜合的序列突變就可以被這樣鑒定出來。三個II型雜合子因子（all SNPs），四個V 雜合子 (2 SNPs, 1 個單堿基的缺失和 1 個復合的雜合子)和 6 HFE雜合子 (4 SNPs and 2復合雜合子)可被用來做比較。在選擇和完全鑒定樣品之后，通過ND-1000 (NanoDrop Technologies, Inc.)來確定DNA的濃度。如果可以的話，每個雜合子基因型的3個樣品可以被處理。
除非有必要重新設計引物來檢測所有的序列突變，前面描述的引物可以直接去用。SNPWizard 可以(http://DNAWizards.path.utah.edu)被用來設計引物。引物通過Integrated DNA Technologies來合成，并且用的時候不需要進一步的純化。除了將1X LCGreen ? PLUS (Idaho Technology)換成 LCGreen I外，PCR仍采用以前的程序來擴增。LCGreen PLUS比LCGreen I顏色更加鮮艷，并且可以被用在具有更寬廣變化的熔解測定儀上。擴增時的擴增子的序列，引物區域和特定的PCR條件被列在數據附錄的表1中。數據附錄是和在線版本的技術簡要說明（http://www.clinchem.org/content/vol51/issue7/）相匹配的。
PCR結束以后，毛細管在LightCycler中以20 °C/s的速度被加熱到90 °C，然后以20 °C/s的速度冷卻到40 °C以便更好的形成異源二聚體。將樣品從LightCycler中取出，然后在高分辨率的熔解曲線儀(HR-1; Idaho Technology)上進行分析。每個毛細管在59 °C時被插到儀器中，溫度以0.3 °C/s的速度上升，從65 到95 °C時獲取熒光，此過程只需要1至2分鐘。通過熔解前的快速降溫，熔解過程中的快速加熱以及低濃度的Mg離子濃度均有助于檢測小的擴增子中異源二聚體。通過普通化的用戶軟件來分析熔解曲線，不同溫度遷移的曲線以不同的圖片形式被列出來。不同的圖片顯示出每個樣品和“標準”（通常是多種野生型曲線的一個平均值）樣品之間的區別，并且不應該與衍生圖 (-dF/dT)相混淆，這種衍生圖 (-dF/dT)常常被用來分析低分辨率的熔解數據。因為曲線形狀和熔解溫度的微小差別就會變得異常明顯，因此，作為一種方便的方法，不同的圖可從整體上觀察高分辨率的熔解數據。
可以通過前面描述過的最近熱力學模型（nearest-neighbor thermodynamic models）的計算來預測出的兩個Tm值。該模型通過安裝Melting Wizard (http://DNAWizards.path.utah.edu)而獲得。沒有必要去修正因dUTP 代替dTTP的滲入而造成的影響。為了最大程度的增加Tm的區別，擴增子的長度最好比較短，盡管在產物中要想證明SNP的類型常需要超過500 bp的長度。對于不同的SNP( 在線數據附錄中的表格2)，計算出的Tm的差異在純合的野生型和純合的突 變型的擴增子中變化范圍在0.0°C到1.3 °C之間。對于單個的SNP來說，與最穩定的同源雙聚體相比，異源雙聚體的不穩定性常在1.1°C到3.0 °C之間變化，而與最不穩定的同源雙聚體相比，異源雙聚體的不穩定性在0.7°C到2.2 °C之間變化。對于復合雜合子來說，各自的不穩定性在2.8–4.0 °C 和2.0–3.5 °C之間。