高分辨熔解曲線突變檢測

高分辨熔解曲線（High Resolution Melting）技術是近年來興起的一種全新的突變掃描和基因分型的遺傳分析方法。HRM不受突變堿基位點與類型局限，無需序列特異性探針，在PCR結束后直接運行高分辨熔解，即可完成對樣品的分析。該方法與其他遺傳分型技術相比具有靈敏度高、特異性好、成本低廉、高通量檢測的優點，是進行突變檢測的迅速、廉價而有效的方法。

HRM原理

HRM是在PCR基礎上通過測定DNA雙鏈熔解曲線變化來檢測突變的方法，溶解曲線的變化取決于DNA序列、長度、GC含量，因此，可以通過飽和燃料監控熔解曲線的變化來反映核酸性質的差異，從而對樣品進行分析。

在雙鏈體的溶解曲線檢測時需要添加合適的染料，飽和染料例如SYBR Green在雙鏈解鏈過程中會發生重排，無法真實反映DNA熔解情況。不適用于需低溫解鏈的樣品而且不能檢測異源雙鏈體。因此不能用于熔解曲線的檢測。而LC Green是一種與DNA有更強的結合位點，對PCR抑制作用很小的飽和染料，已成功的用于HRM檢測中。

HRM操作簡便，在PCR結束后添加合適的染料，通過監測升溫過程中熒光染料與PCR擴增產物的結合情況來實現的，在升溫過程中，雙鏈解開，熒光染料從解鏈的分子上釋放，同時熒光強度降低，所以通過熒光強度和曲線的變化上就可以判斷是否存在突變。

圖一：同源雙鏈體和異源雙鏈體的熔解曲線

圖二：HRM數據處理過程

HRM的特點和應用

HRM應用：

• 檢測人類疾病相關基因中常染色體的顯隱性和X-連鎖

• 鑒定人類腫瘤的體細胞突變，腫瘤樣品中篩選體細胞突變

• 基因突變掃描：單堿基的改變、插入或缺失

• 特定突變、多態性位點的篩選

• 外顯子和短擴增子基因型掃描

HRM特點：

• 靈敏度高：雜合子突變體的檢測的靈敏度可以達到100%，原則上數據分析時溫度升高后純合子或半合子的突變時檢測不到的，但實際上，許多純合子突變是可以檢測到的。如基因突變正好與x連鎖，可以在PCR之前加入已知野生型樣本來檢測半合子或純合子的突變。

• 特異性好：HRM的特異性可以達到90-100%。短的擴增子特異性要更高

• 不受堿基位點局限，適用范圍廣

• 在封閉的試管內進行，可降低污染操作簡單、

• 成本低廉、時間少、誤差小、高通量檢測

• 檢測的樣品范圍廣：HRM檢測片段范圍在38-1000bp不同來源的樣品都可以用于HRM如血粉、口腔細胞、冷凍的腫瘤樣品、也可用于酒精固定、福爾馬林固定或石蠟包埋的組織等，在人類遺傳性疾病的研究中，通常用周邊血液淋巴細胞中提取DNA，用于HRM分析。
  

HRM：實驗設計中需要考慮的問題

• 高效的擴增方案的設計對于HRM的成功至關重要。最大的靈敏度和特異性有助于最佳的PCR結果的產生，同時擴增子的溶解特性對于結果也非常重要。這取決于引物的設計和引物的位置。

• 在實驗結果中有時會出現假陽性，這時可以通過調整引物或者擴增參數避免出現假陰性的結果。

• 樣品的質量對特異性有一定的影響，因此，進行HRM分析時要選用高質量的樣品。

總結

HRM靈敏度高、特異性好

該方法是在封閉的試管內進行，可降低污染，因此，該技術具有操作簡單、成本低廉、時間少、誤差小、高通量檢測的優點。是進行突變掃描的首選方法。