高分辨質譜儀實現非變性狀態ADCs藥物的分析（二）

2.3數據處理

采用Thermo Scientific^TM Protein Deconvolution 3.0對原始質譜圖進行去卷積。

參數如下：

3實驗結果

本實驗通過直接進樣方式，分別設置Orbitrap分辨率為17500，35000，70000， ADCs藥物的原始質譜圖如圖3，ADCs藥物的質譜峰主要分布在m/z 5000-7000范圍內，具有理想的信噪比。選取兩組質譜峰進行放大（圖4所示）可以發現，當逐漸提高質譜分辨率時，主峰逐漸與加合離子峰分離。分辨率越高，分離效果越明顯。

經Protein Deconvolution 3.0軟件去卷積處理之后的不同分辨率下的ADCs藥物分子質量分布如圖5所示，根據ADCs藥物單抗的氨基酸序列和小分子藥物的理論分子量進行計算，將觀察到的質譜峰進行歸屬，從圖中我們觀察到，五個主峰呈現等質量間隔（約2635Da），由此可推斷該單抗分子結合了不同數目的藥物小分子。結合cysteine-linked ADCs的特點，判斷主峰依次為結合了0、2、4、6、8個小分子藥物的ADCs混合物，該結果與理論預期一致。

圖3 不同分辨率設置下（17500，35000，70000）ADCs藥物的原始質譜圖

圖4 不同分辨率設置下（17500，35000，70000）ADCs藥物局部放大質譜圖

圖5 不同分辨率設置下（17500，35000，70000）ADCs藥物去卷積后結果

表1不同分辨率（17500，35000，70000）下去卷積后的精確分子量和質量偏差

不同分辨率（17500，35000，70000）下去卷積后的精確分子量如表1所示，比較發現，當分辨率設置為17500時，由于無法實現主峰和加合離子峰的有效分離，質量與理論值偏差較大，最大偏差達到7.7Da。當分辨率逐漸提升到35000，主峰逐漸與加合離子峰分離，質量偏差控制在0.3-1.6Da，具有極佳的質量準確度。當分辨率逐漸進一步提升到70000時，主峰與加合離子峰分離度進一步提高，同樣可獲得理想的質量準確度（0.2-2.7Da），滿足測定需求。

根據質譜峰的峰強度信息，可計算該藥物的DAR值，該數值對于ADCs藥物的有效性評估至關重要。以分辨率設置35000下質譜圖去卷積結果為例（如圖6所示），按照DAR = Σ(relative peak area×number of loaded drugs)/100計算DAR值，獲知該ADCs藥物DAR=3.9。

圖6 分辨率設置35000下質譜圖去卷積后ADCs藥物質量分布圖（D0-D8表示載有不同藥物分子數的ADCs混合物）

4結論

本文采用Exactive Plus EMR質譜儀，直接進樣方式，突破了傳統的RPLC/MS平臺無法進行cysteine-linked ADCs分析的瓶頸，建立了cysteine-linked ADCs的精確分子量測定方法，為cysteine-linked ADCs 單抗藥物研發和生產檢測提供了高效、快速的分析平臺。實驗結果表明Exactive Plus EMR質譜儀憑借其超高的分辨率、超快的掃描速度、超高的質量精度、超高的靈敏度以及拓展的質量范圍，極大地完善和推動了ADCs藥物的鑒定分析。

參考文獻

1. Albert J R Heck et al. Nat. Methods 2008, 5(4), 927-933.

2. Sara Rosati et al. Nature Protocols 2014,9(4) , 967-976