許多真核生物的基因所包含的 DNA，遠非單個重組子所能容納得了的。對于大多數染色體來說，更是如此。因此，必須構建一套重疊的 DNA 克隆，這些克隆的 DNA 按次序排列能形成疊連序列（疊連群），可以涵蓋一個很大的基因或目的區域。本實驗來源「分子克隆實驗指南第三版」黃培堂等譯。
| 實驗方法原理 | 許多真核生物的基因所包含的 DNA，遠非單個重組子所能容納得了的。對于大多數染色體來說，更是如此。因此，必須構建一套重疊的 DNA 克隆，這些克隆的 DNA 按次序排列能形成疊連序列（疊連群），可以涵蓋一個很大的基因或目的區域。 |
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| 實驗材料 | T4 噬菌體 DNA 連接酶限制性內切核酸酶 PstⅠ或 NsiⅠ耐熱性 DNA 聚合酶模板 DNA |
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| 試劑、試劑盒 | 擴增緩沖液dNTP 溶液乙醇酚氯仿醋酸鈉T4 DNA 連接緩沖液 |
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| 儀器、耗材 | 瓊脂糖凝膠核酸和寡核苷酸寡核苷酸盒帶過濾層吸頭薄壁微量離心管移液器程控式 PCR 儀水浴或冷卻裝置 |
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| 實驗步驟 | 一、材料
1. 緩沖液和溶液
10X 擴增緩沖液
dNTP 溶液（1 mmol/L，包括所有 4 種 dNTP ( pH 8.0；PCR 級)
乙醇
酚：氯仿（1:1, V/V）
醋酸鈉（3 mol/L, pH 5.2）
10X T4 DNA 連接緩沖液
2. 酶及其緩沖液
T4 噬菌體 DNA 連接酶
限制性內切核酸酶 PstⅠ或 NsiⅠ
耐熱性 DNA 聚合酶
3. 凝膠
瓊脂糖凝膠
核酸和寡核苷酸
寡核苷酸盒 [ 5.0 OD260/ml (~8.5 μmol/L)]，用 TE ( pH 7.6) 溶解 5'CATGCTCGGTCGGGATAGGCACTGGTCTAGAGGGTTAGGTTCCTGC TACATCTCCAGCCT TGCA3'
寡核苷酸（接頭）引物 [ 5.0 OD260/ml (~17 μmol/L) ], 用 TE ( pH 7.6 ) 溶解。 5'CATGCTCGGTCGGGATAGGCACTGGTCTAGAG3'
序列特異性寡核苷酸（載體) 引物 [ 5.0 OD260/ml (~17 μmol/L) ]。用 TE ( pH 7.6 ) 溶解。
模板 DNA: 重組 BAC、YAC 或黏粒 DNA
4. 專用設備
自動移液器用的帶過濾層吸頭
擴增用的薄壁微量離心管（0.5 ml)
陽性對照專用的移液器
儲存有擴增程序的程控式 PCR 儀
15℃ 水浴或冷卻裝置
二、方法
1. 用 PstⅠ或 NsiⅠ消化約 5 μg 模板 DNA。取一小份反應產物，進行瓊脂糖凝膠電泳，以確證所有的 DNA 都已經被酶解。
2. 用酚: 氯仿抽提混合液及標準的乙醇沉淀法回收 DNA，然后用 70% 的乙醇洗滌沉淀。將管子開口倒扣在一疊衛生紙巾上，使最后殘留的乙醇揮發，然后用 50 μl H2O 溶解濕潤的 DNA 沉淀。
3. 在一個無菌的 0.5 ml 的微量離心管中，依次加入下列物質：10X T4 DNA 連接酶緩沖液 10 μl，消化后的 DNA 模板 20 μl，寡核苷酸盒子 5.0 OD260/ml 2 μl，T4 噬菌體 DNA 連接酶 5 Weiss 單位/μl 2 μl，加水至 100 μl。
設 3 個對照管，對照管的體系參照上述配方。其中一個無模板 DNA，另一個無寡核苷酸接頭，第 3 個無 T4 DNA 連接酶。
4. 將實驗管及對照管在 15℃ 下連接 12~16 h。
5. 在一個無菌的 0.5 ml 的微量離心管中，依次加入下列物質：10X 擴增緩沖液 2 μl，1 mmol/L 4 種 dNTP 混合溶液（pH 7.0） 2 μl，接頭的寡核苷酸引物 5.0 OD260/ml 1 μl，載體的寡核苷酸引物 5.0 OD260/ml 1 μl，取自步驟 4 的實驗管 DNA 連接產物 1 μl，耐熱 DNA 聚合酶 5.0 單位/μl 0.5 μl，加水至 20 μl。
設 3 個 PCR 對照。每只對照管中含有連接反應中相對應的對照反應液 1 μl。
6. 如果 PCR 儀沒有高溫頂殼，在反應混合體系里加一滴（約 50 μl）輕礦物油，以防止加熱和冷卻循環時樣品的蒸發。另外，如果用熱啟動則加一滴石蠟。
7. 將 PCR 管放入 PCR 儀中，按下表輸入程序后，開始擴增。
8. 將每一管擴增產物都取出一份（25%)，用瓊脂糖凝膠電泳分析。
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