由于多肽藥物結構復雜、穩定性差、濃度低且目標分子與雜質的結構相類似，有的只有一個氨基酸的差別，因此多肽藥物的分離純化一直是多肽藥物生產過程中最具挑戰性的一部分，多肽分離純化也主要依賴于高性能的微球制備色譜填料，其具有分離效果好、分辨率高、重復性好、回收率高等優點，是目前多肽藥物的主要分離純化方法。無論是多肽藥物的合成還是分離純化都離不開高性能的微球材料。
傳統重結晶、精餾等有機小分子藥物純化方法不適用于多肽的分離純化，高效液相色譜或層析技術具有極高的分離純化效率，且條件溫和，在分離純化過程中容易保持目標分子的生物活性，成為多肽藥物分離純化的重要工具。
分離純化技術對于生物分子的形態、收率和成本具有決定性的作用。尤其是通過發酵生產的多肽藥物如重組胰島素，由于濃度低、雜質復雜，目標產物容易變性等使其分離成本占總成本的60%以上，而且需要多步純化過程才能滿足多肽藥物的需求，因此，分離純化技術在多肽藥物產業中起著十分重要的作用。
目前用于多肽藥物分離純化的層析或色譜技術主要是有三種:
一是離子交換色譜，由于多肽是由氨基酸通過酰胺鍵連接成的高分子物質，不同多肽分子帶的表面電荷正負性質及表面電荷數量都不同而且會隨著流動相的pH改變而改變，因此不同組份的多肽分子在離子層析介質的電荷作用力有較大差異，因此可以通過改變水溶液的鹽濃度和pH來降低樣品組份與離子交換色譜填料的電荷作用力從而對不同多肽組份進行洗脫分離。
離子交換樹脂分為強陽、強陰、弱陽、弱陰四種常用離子交換介質，離子交換具有載量大、適用性強等特點，因此常被用于發酵多肽產品的粗分和中間純化過程，如重組胰島素的第一步粗分往往是用離子交換色譜。
二是反相色譜，多肽分子在極性較強的流動相如水的緩沖液中可以與色譜填料表面疏水基團形成較強的疏水作用力而吸附在固定性表面上，然后通過降低流動相極性即增加流動相有機溶劑的比例如甲醇、乙腈等按極性強弱先后洗脫分離不同多肽樣品組分。
樣品流出色譜柱的順序是極性較強的多肽組份最先被沖洗出，而極性較弱的組份會與色譜填料有更強的疏水作用力因此在色譜柱上有更強的保留。反相色譜填料分辨率很高通常用于多肽藥物分離的精純過程。
三是疏水作用色譜，與反相色譜相類似都是通過樣品組份帶有的疏水基團與色譜填料表面基團通過疏水作用力達到吸附的目的，然后通過調整流動相性質來改變這種疏水作用力來達到分離的目的。
不同的是反相填料具有高密度的疏水功能基團，疏水作用力很強，樣品組分在純水緩沖溶液中就可以吸附在反相填料表面，洗脫時需要增加流動相中有機溶劑的比例以降低流動相的極性；而疏水填料表面疏水基團密度小，疏水作用力較弱，為了增加多肽的疏水作用力，在水流動相中需要增加鹽的濃度使樣品能吸附在疏水填料表面，然后只要降低流動相鹽的濃度就可以達到洗脫的目的。
疏水作用色譜優勢是可以完全在水相體系操作，不需要有機相。常見的疏水基團有苯基、丁基和聚醚基團。疏水層析介質的疏水作用力主要受流動相的鹽濃度影響，由于其在高鹽環境下，多肽分子的疏水性較好，因此其非常適用于離子交換色譜過程之后產品的繼續分離純化。