高效反相液相色譜

huBPP

甲醇（HPLC級 三氟己酸（TFA） 乙腈 （HPLC級） 雙蒸水

高效液相色譜儀 Beckman公司gold system 進樣針 離心管 離心機 冰箱 試管 色譜柱Diamonsil TM（鉆石）

一、樣品制備

1.提取

在室溫下，稱取（2 ± 0.05）g組織樣品于50 mL離心管內，加乙酸乙酯15 mL，渦旋混勻提取3 min，離心10 min（4000 rpm），移取乙酸乙酯層至50 ml梨形瓶中。殘渣中加0.1 mol/L NaOH溶液10 mL，混勻，加乙酸乙酯15 mL提取后移取乙酸乙酯層。合并兩次提取液，40 ℃下減壓濃縮近干，加入乙酸乙酯1.0 mL和正己烷5 mL,使之充分溶解，待凈化。

2.凈化

用Silica固相萃取柱進行SPE凈化。用正己烷5 mL活化固相萃取柱后，上樣，先用正己烷 5 mL淋洗，抽干，然后用正己烷——丙酮（6∶4，v/v）5 mL洗脫。洗脫液在40 ℃下 N2吹干，以20％乙腈水溶液1.0 mL溶解殘渣，過0.45 μm濾膜，供LC/MS/MS法測定液相色譜及質譜條件

二、色譜條件

1.色譜柱：Thermo Hypersil Gold （150 × 2.1 mm,5 μm）；梯度洗脫見表1，其中A：水（含0.01 %甲酸）；B：乙腈；流速：250 μL/min；進樣量：10 μL。

2.質譜條件

電噴霧電離源（ESI），負離子模式；選擇反應監控（SRM）掃描模式，噴霧電壓：3500 V；離子傳輸管溫度：350 ℃；氮氣作為鞘氣和輔助氣，其中鞘氣為40 arb, 輔助氣為5 arb，氬氣用作碰撞氣， 碰撞壓力為1.5 mTorr; 選擇反應監測（SRM）。

色譜柱操作說明，（以迪馬公司Diamonsil（TM）柱為例）

1. 色譜柱常規參數

訂貨號：Catalog.No.             產品ZL號 Serial No.

出廠日期  Date

填料  Column Paking     如，Diamonsil（TM）鉆石C18 5цm

柱規格 Column Dimension     250×4.6mm

填料批號 Material Lot No.   0206

保證柱效 Guarantee Plate Number   N>70,000/m（usp 1/2 Peak height）

不對稱因子 Asmmetry Factor        As=0.8-1.4（5% Peak height）

測試報告 （附色譜圖） 略

2. 驗收色譜柱

⑴ 檢查色譜柱外觀是否完好。

⑵按柱參數逐項檢查是否與您的需求相符，如規格等。

3. 流動相使用

⑴檢查色譜柱允許使用流動相及pH，如，凝膠柱常規用緩沖液，反相柱用有機溶劑，鉆石C18柱允許pH為2-7.5。

⑵ 注意流動相的粘度對柱后的影響，如甲醇/水系統高于乙腈/水系統。

⑶ 流動相、樣品使用時過濾，常用0.45μm膜，分清水溶性和脂溶性膜。一般在色譜柱口有0.2μm的膜保護，以免堵塞色譜柱。

⑷ 流動相應脫氣。

4. 色譜柱安裝

⑴ 確證柱與儀器的接頭，管路匹配。

⑵ 安裝柱之前，檢查流路系統中的溶劑是否正常。

⑶ 為減少死體積使進樣閥與色譜柱和檢測器之間的連接管路內徑盡量細，如0.01英寸。

5. 對樣品要求

⑴ 樣品應與流動相互溶。

⑵ 樣品濃度要在一定范圍內，不同色譜柱要求不同。

⑶ 樣品中不能有不溶物，用前應用針頭或過濾器過濾。

⑷ 樣品不應與流動相發生反應。

6. 色譜柱的使用

⑴ 色譜柱最后封裝的溶劑一般與檢測報告相同或特別注明，若更換流動相時，流速要慢，一般不超過0.5ml/mim。

⑵ 請勿頻繁改變流動相，否則，會加速降低柱效。

⑶ 注意不同色譜柱耐壓程度不同，壓力要在柱耐壓范圍內，為獲得最佳分離效果，鉆石C18柱使用勿超過200bar（300psi）。

⑷ 若使用保溫柱時，注意溫度影響。

7. 色譜柱的保存

⑴ 若流動相中使用鹽或酸試劑，保存前應先用水沖洗干凈（約20倍柱體積）。

⑵ 泵入保存液，不同色譜柱用不同保存液，鉆石C18柱應盡可能用100%乙腈或甲醇保存。

⑶ 卸下色譜柱后，立即用接頭密封，放在穩定環境中保存。

8. 柱的再生

不同柱用不同方法再生，請參看各種色譜柱說明。

鉆石反相鍵合相C18、C8、pH、CN柱用以下程序：

用20倍柱體積的溶劑按下列程序沖洗色譜柱。（按箭頭方向沖）

水→甲醇→氯仿→甲醇

水沖洗時可用熱蒸溜水（55℃）或加入少量（0.8%）DMSO沖洗。

一般情況下不提倡反向沖洗色譜柱，必要時可反向沖。

由于在反相色譜中，使用了乙腈、甲醇等價格高且有一定毒性的試劑，在一定程度上使該方法的使用受到限制。例如可使部分蛋白失活。因此，該方法用在分析鑒定方面更多一些，特別是對有機溶劑具有耐受性的樣品。例如多肽樣品，可用HPRPC對合成的肽huBPP進行分析。