高效反相液相色譜

反相色譜（reversed phasc chromatography, RPC）是基于溶質、極性流動相和非極性固定相表面間的疏水效應建立的一種色譜模式，任何一種有機分子的結構中都有非極性的疏水部分，這部分越大，一般保留值越高，在高效液相色譜中這是應用面最廣的一種分離模式，在生物大分子的反相液相色譜條件下，流動相多采用酸性的、低離子強度的水溶液，并加一定比例的能與水互溶的異丙醇、乙腈或甲醇等有機改性劑，大量使用的填料為孔徑在30納米以上的硅膠烷基鍵合相，除此之外，也有少量高聚物微球。實驗表明，烷基鏈長對蛋白質的反相保留沒有顯著的影響，但在蛋白質的活性回收上短鏈烴基（如C₄，C₈，苯基）和長鏈烷基（如C₁₈，C₂₂）反相填料是有區別的。表現在烷基鏈越長，固定相的疏水性越強，因而為使蛋白質較快洗脫下來，需要增加流動相的有機成分。過強的疏水性和過多的有機溶劑會導致蛋白質的不可逆吸附和生物活性的損失。總起來說，在烷基鍵合硅膠上的反相色譜，由于其柱效高、分離度好、保留機制清楚，是蛋白質的分離、分析、純化和結構闡明廣泛使用的一種方法。

由于在反相色譜中，使用了乙腈、甲醇等價格高且有一定毒性的試劑，在一定程度上使該方法的使用受到限制。例如可使部分蛋白失活。因此，該方法用在分析鑒定方面更多一些，特別是對有機溶劑具有耐受性的樣品。例如多肽樣品，可用HPRPC對合成的肽huBPP進行分析。

（一）實驗目的
用HPRPC對huBPP進行純度鑒定。

（二）材料和試劑

1，儀器：高效液相色譜儀，Beckman公司gold system.

2，色譜柱：⑴ 名稱：Diamonsil TM（鉆石） C18柱，5цm

                      ⑵ 規格：250×4.6mm

3，試劑：甲醇（HPLC級）、三氟己酸（TFA）、乙腈  （HPLC級）、雙蒸水

（三）樣品準備
取待分析的huBPP，稱量，用0.1%的TFA液溶解，配制成濃度大于1mg/ml的液體。必要時過濾或離心。

（四）操作

1、液體準備：A液0.1%TFA，B液液，99.9%乙腈，0.1%TFA，脫氣。

2、開機

3、上柱

4、輸入參數

檢測波長  245nm

流速  1ml/min

流動相： A液：0.1%TFA

                B液：99.9%乙腈-0.1%TFA

洗脫條件：0-100% B  20min

5、平衡色譜柱  一般反相柱都保存在甲醇中，應置換出甲醇，用A液平衡色譜柱，待基線平穩后準備上樣。必要時，可按洗脫條件不上樣運行一遍程序，以洗出色譜柱可能存在的雜質。

6、上樣，取20цl樣，注入上樣閥，將閥門扳下，即上樣。

7、進行分離，鑒定。

8、打印結果，并分析，可得到峰數，峰高，面積百分比，保留時間等參數。

9、用B液洗柱5min，若不再使用時，換成甲醇，洗滌后保存。

附：色譜柱操作說明，（以迪馬公司Diamonsil(TM)柱為例）

1. 色譜柱常規參數

訂貨號：Catalog.No.             產品ZL號 Serial No.

出廠日期  Date

填料  Column Paking     如，Diamonsil(TM)鉆石C18 5цm

柱規格 Column Dimension     250×4.6mm

填料批號 Material Lot No.   0206

保證柱效 Guarantee Plate Number   N>70,000/m(usp 1/2 Peak height)

不對稱因子 Asmmetry Factor        As=0.8-1.4(5% Peak height)

測試報告 （附色譜圖） 略

2. 驗收色譜柱

⑴ 檢查色譜柱外觀是否完好。

⑵按柱參數逐項檢查是否與您的需求相符，如規格等。

3. 流動相使用

⑴檢查色譜柱允許使用流動相及pH，如，凝膠柱常規用緩沖液，反相柱用有機溶劑，鉆石C₁₈柱允許pH為2-7.5。

⑵ 注意流動相的粘度對柱后的影響，如甲醇/水系統高于乙腈/水系統。

⑶ 流動相、樣品使用時過濾，常用0.45μm膜，分清水溶性和脂溶性膜。一般在色譜柱口有0.2μm的膜保護，以免堵塞色譜柱。

⑷ 流動相應脫氣。

4. 色譜柱安裝

⑴ 確證柱與儀器的接頭，管路匹配。

⑵ 安裝柱之前，檢查流路系統中的溶劑是否正常。

⑶ 為減少死體積使進樣閥與色譜柱和檢測器之間的連接管路內徑盡量細，如0.01英寸。

5. 對樣品要求

⑴ 樣品應與流動相互溶。

⑵ 樣品濃度要在一定范圍內，不同色譜柱要求不同。

⑶ 樣品中不能有不溶物，用前應用針頭或過濾器過濾。

⑷ 樣品不應與流動相發生反應。

6. 色譜柱的使用

⑴ 色譜柱最后封裝的溶劑一般與檢測報告相同或特別注明，若更換流動相時，流速要慢，一般不超過0.5ml/mim。

⑵ 請勿頻繁改變流動相，否則，會加速降低柱效。

⑶ 注意不同色譜柱耐壓程度不同，壓力要在柱耐壓范圍內，為獲得最佳分離效果，鉆石C₁₈柱使用勿超過200bar(300psi)。

⑷ 若使用保溫柱時，注意溫度影響。

7. 色譜柱的保存

⑴ 若流動相中使用鹽或酸試劑，保存前應先用水沖洗干凈（約20倍柱體積）。

⑵ 泵入保存液，不同色譜柱用不同保存液，鉆石C₁₈柱應盡可能用100%乙腈或甲醇保存。

⑶ 卸下色譜柱后，立即用接頭密封，放在穩定環境中保存。

8. 柱的再生

不同柱用不同方法再生，請參看各種色譜柱說明。

鉆石反相鍵合相C₁₈、C₈、pH、CN柱用以下程序：

用20倍柱體積的溶劑按下列程序沖洗色譜柱。（按箭頭方向沖）

水→甲醇→氯仿→甲醇

水沖洗時可用熱蒸溜水（55℃）或加入少量（0.8%）DMSO沖洗。

一般情況下不提倡反向沖洗色譜柱，必要時可反向沖。