分離單元（高效液相色譜柱）
色譜柱是高效液相色譜儀的核心部件。
色譜法最核心的機制就是把樣品中各個組分進行有效分離，而實現分離靠的就是色譜柱。
色譜柱選擇時需要考慮四大參數：固定相類型（填料種類）、柱長、柱內徑、填料粒度。
固定相類型：目前主要有硅膠基質的ODS(碳十八)、氨基、氰基、苯基、硅膠等色譜柱，以及高分子聚合物的固定相填料。目前ODS(碳十八)應用最為廣泛，高效液相色譜法大約有80%分離采用的就是ODS(碳十八)填料。
柱長：色譜柱的長度越長，分離效果越好，但是背壓也就越大、柱子價格就會越貴。目前柱長應用較多的是375px、500px、625px這三個長度，尤其以625px最多。
柱內徑：其它幾個柱參數不變的情況下，高效液相色譜柱的內徑越小，分離度越好（分離度越高），但是柱負載量越小。常用柱內徑是3.9mm、4.6mm、6.0mm，尤其以4.6mm為最常用。
填料粒徑：根據色譜法的速率理論，填料粒徑越小，分離效果越好；但是填料粒度越小，在同樣的流動相輸送流速下，對于高效色譜儀高壓泵的背壓也就越大，對于高壓泵的加壓能力、密封性能也就要求越高。高效液相色譜儀一般采用3微米、5微米或10微米的填料粒徑，而3微米以下粒徑的填料，通常應用于超高效液相色譜儀。高效液相色譜法應用最多的是5微米粒徑的填料。
分離單元還有另外兩個問題需要掂量：是否需要配預柱（保護柱）、是否需要配柱溫箱。
預柱（保護柱）：預柱（保護柱）的存在，會加大色譜死體積，會降低柱效，所以除非樣品特別臟、或有特別多的高分子物質會堵塞分析柱，否則盡量不用預柱（保護柱）。
柱溫箱：因為高效液相色譜法對于溫度的些微波動并不特別敏感，除了一些對于柱溫穩定性要求特別高的分離，高效液相色譜法很多情況下并不需要配置柱溫箱。當然，如果采購預算足夠多，安裝柱溫箱確實能有更好的色譜出峰時間重復性。