高效液相色譜儀結構及應用實例

一、高效液相色譜儀的結構：

HPLC的出現不過三十多年的時間，但這種分離分析技術的發展十分迅猛，目前應用也十分廣泛。其儀器結構和流程也多種多樣。典型的高效液相色譜儀結構和流程可用下列方框圖表示。高效液相色譜儀一般都具備貯液器、高壓泵、梯度洗提裝置（用雙泵）、進樣器、色譜柱、檢測器、恒溫器、記錄儀等主要部件。

1 、高壓泵

HPLC使用的色譜柱是很細的（1～6mm），所用固定相的粒度也非常小（幾μm到幾十μm），所以流動相在柱中流動受到的阻力很大，在常壓下，流動相流速十分緩慢，柱效低且費時。為了達到快速、高效分離，必須給流動相施加很大的壓力，以加快其在柱中的流動速度。為此，須用高壓泵進行高壓輸液。高壓、高速是高效液相色譜的特點之一。

HPLC使用的高壓泵應滿足下列條件：

a 流量恒定，無脈動，并有較大的調節范圍（一般為1～10ml/min）；

b 能抗溶劑腐蝕；

c 有較高的輸液壓力；對一般分離，60×105Pa的壓力就滿足了，對高效分離，要求達到150～300×105Pa。

（1）往復式柱塞泵

當柱塞推入缸體時，泵頭出口（上部）的單向閥打開，同時，流動相進入的單向閥（下部）關閉，這時就輸出少量的流體。反之，當柱塞向外拉時，流動相入口的單向閥打開，出口的單向閥同時關閉，一定量的流動相就由其儲液器吸入缸體中。這種泵的特點是不受整個色譜體系中其余部分阻力稍有變化的影響，連續供給恒定體積的流動相。

（2）氣動放大泵

其工作原理是：壓力為p1的低壓氣體推動大面積（SA ）活塞A，則在小面積（SB ）活塞B輸出壓力增大至p2的液體。壓力增大的倍數取決于A和B兩活塞的面積比，如果A與B的面積之比為50：1 ，則壓力為5×105Pa的氣體就可得到壓力為250×105Pa的輸出液體。這是一種恒壓泵。

2 、梯度洗提

類似于GC中的程序升溫。已成為現代高效液相色譜中不可缺少的部分。

梯度洗提，就是載液中含有兩種（或更多）不同極性的溶劑，在分離過程中按一定的程序連續改變載液中溶劑的配比和極性，通過載液中極性的變化來改變被分離組分的分離因素，以提高分離效果。梯度洗提可以分為兩種：

a 低壓梯度（也叫外梯度）：在常壓下，預先按一定程序將兩種或多種不同極性的溶劑混合后，再用一臺高壓泵輸入色譜柱。

b 高壓梯度 （或稱內梯度系統 ）：利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按設定的比例送入梯度混合室，混合后，進入色譜柱。

3 、進樣裝置

（1）注射器進樣裝置：進樣所用微量注射器及進樣方式與GC法一樣。進樣壓力<150×10⁵Pa，當進樣壓力>150×10⁵Pa時，必須采用停流進樣。

（2）高壓定量進樣閥：與GC法用的流通法相似，能在高壓下進樣。

4、色譜柱

色譜柱是色譜儀最重要的部件（心臟）。通常用后壁玻璃管或內壁拋光的不銹鋼管制作的，對于一些有腐蝕性的樣品且要求耐高壓時，可用銅管、鋁管或聚四氟乙烯管。

柱子內徑一般為1～6mm。常用的標準柱型是內徑為4.6或3.9mm ，長度為15～30cm的直形不銹鋼柱。填料顆粒度5～10μm ，柱效以理論塔板數計大約7000～10000 。

發展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。

5、檢測器

（1）紫外光度檢測器

它的作用原理是基于被分析試樣組分對特定波長紫外光的選擇性吸收，組分濃度與吸光度的關系遵守比爾定律。是最常用的檢測器，應用最廣，對大部分有機化合物有響應。其特點是：

a 靈敏度高：其最小檢測量10^-9g·ml^-1，故即使對紫外光吸收很弱的物質，也可以檢測；

b 線性范圍寬；（比爾定律）

c 流通池可做的很小（1mm×10mm，容積8μl）；

d 對流動相的流速和溫度變化不敏感，可用于梯度洗脫；

e 波長可選，易于操作：如，使用裝有流通池的可見紫外分光光度計（可變波長檢測器）。

缺點：對紫外光完全不吸收的試樣不能檢測；同時溶劑的選擇受到限制。

（2）光電二極管陣列檢測器

紫外檢測器的重要進展；陣列由1024個光電二極管陣列，每個光電二極管寬僅50μm，各檢測一窄段波長。如圖所示，在檢測器中，光源發出的紫外或可見光通過液相色譜流通池，在此流動相中的各個組分進行特征吸收，然后通過狹縫，進入單色其進行分光，最后由光電二極管陣列檢測，得到各個組分的吸收信號。經計算機快速處理，得三維立體譜圖。

（3）熒光檢測器

熒光檢測器是一種高靈敏度、高選擇性檢測器。對多環芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應。熒光檢測器的結構及工作原理和熒光光度計相似。

（4）差示折光檢測器

除紫外檢測器之外應用最多的檢測器。差示折光檢測器是借連續測定流通池中溶液折射率的方法來測定試樣濃度的檢測器。溶液的折射率是純溶劑（流動相）和純溶質（試樣）折射率乘以各物質的濃度之和。因此溶有試樣的流動相和純流動相之間折射率之差表示試樣在流動相中的濃度。

（5）電導檢測器

其作用原理是根據物質在某些介質中電離后所產生電導變化來測定電離物質含量。