高效液相色譜光化學

  1、引 言

    磺胺(Sulfonamides，SAs)是一類廣譜抗菌藥物，廣泛應用于水產養殖業和畜牧業，是預防和治療細菌感染性疾病的化學藥物。磺胺類藥物還用于馬、牛的傳染性腦膜炎，羊下痢、豬下痢和弓形體病，并且對于禽類球蟲病具有較好療效。由于養殖業中磺胺類藥物的使用導致了動物源性食物中殘留，從而危害人體健康。我國和歐盟均規定了磺胺在動物組織中的最高殘留限量。動物組織中磺胺的檢測方法主要有液相色譜串聯質譜法，液相色譜紫外檢測法，液相色譜熒光檢測法。磺胺類藥物自身不具有熒光活性，采用熒光檢測法時通常需要進行柱前或柱后化學試劑衍生才能進行檢測。研究發現，磺酰胺基是光化學活性基團，在紫外光照射下會發生光化學反應，產物具有熒光性質，通過熒光光度法可以對其進行檢測。最近研制出一種光化學在線衍生器，應用于高效液相色譜后，可以進行在線光化學衍生使分子產生熒光活性，利用熒光檢測器可以有效地檢測。相比于柱前或柱后化學試劑衍生法，光化學衍生不需要額外的衍生化試劑，也不需要柱后衍生反應的試劑泵，減少了人工操作，同時也避免衍生化過程中人為操作因素帶來的誤差。光化學衍生不引入其他雜質，減少了人體與有毒試劑的接觸和曝露，更加綠色、環保、簡便、快捷。到目前為止，關于光化學柱后衍生高效液相色譜熒光法在磺胺類藥物檢測上的應用尚未見報道。本實驗系統研究了光化學衍生的實驗條件，建立了簡便，可靠，靈敏度高的動物組織中磺胺藥物殘留的檢測方法。

    2、實驗部分

    2.1 儀器與試劑 

    Agilent 1260高效液相色譜儀配熒光檢測器(美國Agilent公司)；光化學衍生器(由紫外燈(11W)、聚四氟乙烯反應管(25m × 0.25mm)組成，北京華安麥科公司)；高速勻漿機(德國IKA公司)；高速離心機(美國Thermo公司產品)；旋轉蒸發儀(德國IKA公司)；氮氣吹干儀(天津市恒奧科技有限公司)；渦旋混合器(太倉市華利達實驗設備有限公司)。

    甲醇、乙腈(色譜級，德國Merck公司)；甲酸、正己烷(色譜級，美國TEDIA公司)；實驗用水為Milli-Q超純水。

    標準物質：磺胺嘧啶(純度≥99.5%)，磺胺噻唑(純度≥99.5%)，磺胺甲基嘧啶(純度≥99.2%)，磺胺吡啶(純度≥99.0%)，磺胺二甲基嘧啶(純度≥99.0%)，磺胺對甲氧嘧啶(純度≥98.0%)，磺胺氯噠嗪(純度≥99.0%)，磺胺甲氧噠嗪(純度≥99.2%)，磺胺二甲異噁唑(純度≥98.0%)，磺胺苯甲酰(純度≥99.0%)，磺胺喹噁啉(純度≥98.0% )。標準物質均購于德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。

    標準溶液的配制：分別準確稱取10.0mg上述標準品于10.0mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成1.0g/L的儲備液，于-18℃儲存。分別吸取1.0g/L的標準溶液50μL于10.0mL容量瓶中，用甲醇定容，配成5.0mg/L混合標準溶液，用時用流動相稀釋成一系列濃度的標準溶液。

    2.2 色譜條件

    Eclipse Plus C18液相色譜柱(250mm × 4.6mm，5.0μm； Agilent公司)；柱溫：35℃；進樣量50μL；流動相A為甲醇，B為乙腈，C為水(均含0.2%(V/V)乙酸)，梯度洗脫：0.0～12.0min，10% A，5% B，85% C；12.0～28.0min，10% A，5%～32% B，85%～58% C；30.00～33.00min，10% A，32% B，58% C；33.00～33.10min，10% A，32%～5% B，58%～85% C。流速1.0mL/min。光化學衍生器紫外燈照射波長254nm，照射時間為1min。熒光檢測器：激發波長248nm，發射波長350nm；激發波長248nm，發射波長412nm。

    2.3 樣品前處理

    稱取肉樣5.0g(精確到0.01g)于50.0mL離心管中，加入5g無水Na2SO4，20mL乙腈，用高速勻漿機以12,000r/min勻漿2min，以8,000r/min離心10min，上清液轉移至100mL燒瓶中，殘留物用20mL乙腈重復提取一次，合并上清液。用旋轉蒸發器在40℃，17kPa負壓下蒸至近干，用氮氣吹干殘余液，加入1.0mL流動相和1.0mL正己烷充分溶解，轉移至2.0mL離心管中，以8,000r/min離心10min，棄去上層正己烷，再次加入0.5mL正己烷渦旋2.0min，以8,000r/min離心10min，棄去上層正己烷，下層清液過0.22μm濾膜，濾液供HPLC分析。

    3、結果與討論

    3.1 在線光化學衍生反應

    磺胺類藥物自身無熒光特性，不能采用熒光檢測器直接進行檢測。磺酰胺基是光化學活性基團，在紫外光照射下會發生光化學反應，光化學反應的產物可能為4,4'-二氨基二苯酚、苯胺和對氨基苯磺酸的混合產物，產物具有熒光性質。因此可以在柱后加裝光化學衍生器，對磺胺藥物進行在線光化學衍生化，然后采用熒光檢測器進行檢測。磺胺經過紫外光誘導后化學鍵發生變化產生的熒光性，其強度受分子結構的影響較大。因為不同的取代基團對光化學反應的影響不同，所以不同取代基的磺胺藥物的熒光強度也不一樣，激發波長和發射波長也存在著差異，這一點與柱前或柱后化學試劑衍生不同。常規的柱前或柱后化學試劑衍生一般是使目標物衍生化上一個熒光基團，其檢測的激發波長和發射波長一般是該熒光基團的激發波長和發射波長。將磺胺類藥物標準溶液在線光化學衍生化后進行熒光光譜掃描，各磺胺藥物的最佳激發波長在235～260nm之間，最佳發射波長在320～450nm之間，綜合考慮，確定磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺二甲異噁唑和磺胺苯甲酰的激發波長為248nm，發射波長為350nm；磺胺嘧啶、磺胺吡啶、磺胺氯噠嗪、磺胺甲氧噠嗪、磺胺對甲氧嘧啶和磺胺喹噁啉的激發波長為248nm，發射波長為412nm。 

    11種磺胺藥物的標準色譜峰經光化學衍生器衍生前后的效果比較見圖1。11種磺胺藥物的標準溶液在光化學衍生器未開啟時，各磺胺藥物幾乎沒有熒光響應信號(圖1A) ；光化學衍生器開啟后，熒光大幅增強(圖1B)。

    3.2 高效液相色譜條件的優化

    參考磺胺檢測的相關文獻，使用甲醇、乙腈、乙酸溶液三相作為流動相，對比了甲醇、乙腈為有機相與含不同濃度的乙酸溶液組成的流動相對磺胺藥物分離的影響。實驗發現，不含酸的流動相，磺胺的藥物的色譜峰形出現拖尾，部分組分重疊。加入乙酸后，色譜峰形對稱，分離效果好。考察了不同濃度乙酸對色譜峰形的影響，發現0.2%乙酸既能保證較好的分離效果，同時也不影響色譜柱的使用壽命。由于乙腈的洗脫能力較強，磺胺藥物在色譜柱上的保留時間短，部分磺胺分離度較差，甲醇的洗脫能力較弱，分離度好，但是磺胺藥物的保留時間較長，且峰型較扁平。采用合適的甲醇、乙腈、乙酸可得到較好的分離度和較快的分離效率。優化后的色譜分離條件見2.2節，11種磺胺的標準色譜圖見圖1。

圖1 光化學反應前(A)后(B)11種磺胺的高效液相色譜圖

Fig.1 HPLC chromatograms of 11 sulfonamides before (A) and after (B) on-line photochemical derivatization 1: Sulfadiazine, 2: Sulfathiazole, 3: Sulfamerazine, 4: Sulfapyridine, 5: Sulfachloropyridazine, 6: Sulfadoxine, 7: Sulfamethoxy-pyridazine, 8: Sulfameter, 9: Sulfisoxazole, 10: Sulfabenzamide,11: Sulfaquinoxaline.

    3.3 前處理方法的建立

    比較了甲醇、乙腈、乙酸乙酯的提取效果。甲醇的提取效率較低，也不易沉淀蛋白。乙酸乙酯提取有利于下一步的處理，但是提取物的脂肪含量較高，除脂過程很容易損失目標物。乙腈的提取效率較高，而且提取液的脂肪含量較少，處理也相對方便。乙腈提取液帶入的少量脂肪可以用正己烷去除，盡量減少基質的干擾，圖2為凈化后空白樣品和加標樣品的色譜圖。

圖2 11種磺胺空白樣品(A)和加標樣品(B)的高效液相色譜圖

Fig.2 HPLC chromatograms of 11 sulfonamides for blank sample (A) and spiked sample (B) 1: Sulfadiazine, 2: Sulfathiazole, 3: Sulfamerazine, 4: Sulfapyridine, 5: Sulfachloropyridazine, 6: Sulfadoxine, 7: Sulfamethoxy-pyridazine, 8: Sulfameter, 9: Sulfisoxazole, 10: Sulfabenzamide, 11: Sulfaquinoxaline.

    3.4 線性范圍，檢出限和定量限

    采用空白基質液配制系列濃度的標準溶液，以各分析物的峰面積(y)為縱坐標，質量濃度(x)為橫坐標繪制標準曲線，磺胺類藥物在10～500μg/L濃度范圍內呈良好的線性關系，各分析物的相關系數R²>0.999。以3倍信噪比(S/N = 3)計算方法的檢出限，以10倍信噪比(S/N = 10)計算方法的定量限，其中磺胺對甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉的檢出限和定量限分別為0.2和0.5μg/kg；磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺氯噠嗪、磺胺吡啶、磺胺甲氧嗪、磺胺苯甲酰的檢出限和定量限分別為1和3μg/kg；磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺二甲異噁唑的檢出限和定量限為3和10μg/kg，詳見表1。

表 1  11種磺胺的回歸方程、相關系數(R2)、檢出限和定量限

Table 1  Regression equations, correlation coefficients, LOD and LOQ of 11 sulfonamides

磺胺   Sulfonamides	回歸方程   Regression equation	相關系數 R2	檢出限 LOD* (μg/kg)	定量限 LOQ* (μg/kg)
	R
磺胺嘧啶 Sulfadiazine		y = 2017.62x - 61.89	0.9994	1	3
磺胺噻唑 Sulfathiazole		y = 1897.70x + 20.56	0.9995	1	3
磺胺甲基嘧啶 Sulfamerazine		y = 1402.33x - 41.72	0.9994	3	10
磺胺吡啶 Sulfapyridine		y = 11361.75x - 37.15	0.9992	1	3
磺胺氯噠嗪Sulfachloropyridazine		y = 8944.63x - 5.74	0.9998	1	3
磺胺二甲基嘧啶 Sulfadoxine		y = 2200.70x - 50.48	0.9991	3	10
磺胺甲氧嗪 Sulfamethoxypyridazine		y = 4744.01x - 65.01	0.999	1	3
磺胺對甲氧嘧啶 Sulfameter		y = 15699.15x - 18.27	0.9998	0.2	0.5
磺胺二甲基異噁唑 Sulfisoxazole		y = 1456.02x - 29.74	0.9992	3	10
磺胺苯甲酰 Sulfabenzamide		y = 2991.64x + 9.14	0.9994	1	3
磺胺喹噁啉 Sulfaquinoxaline		y = 12776.23x + 1.98	0.9995	0.2	0.5

* LOD: limit of detection, LOQ: limit of quantification.

    3.5 回收率和精密度

    對陰性豬肉樣品進行回收率實驗，添加水平分別為定量限的3倍和5倍，采用優化后的前處理方法對樣品進行處理，每個添加水平重復6次，各磺胺的平均回收率在85.7%～101.1%之間，RSD為1.9%～6.6%，詳見表2。

表 2 豬肉中11種磺胺的加標回收率結果(n = 6)

Table 2  Recoveries for the 11 sulfonamides in pork (n = 6)