高效液相色譜原理

采用高效液相色譜（HPLC）法分離單糖和寡糖，較多采用氨基柱，乙腈和水作為流動相，此法具有完全分離麥汁、發酵液和啤酒中的果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和麥芽三糖的優點。本文采用Hypersil NH2柱分析麥汁、發酵液和啤酒中三糖以內的可發酵糖。

至今尚未見到采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法分離測定啤酒中的各種有機酸的報道，本文采用直接RP-HPLC法，應用Nucleosil C18柱，測定啤酒、發醇液和麥汁中的草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸等有機酸。

一、實驗部分

1.1藥品和試劑

葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、麥芽三糖、木糖、草酸、酒石酸、丙酮酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸、延胡索酸、磷酸氫二鉀藥品均為分析純，乙腈為色譜純。

1.2儀器與色譜條件

PE200系列高效液相色譜儀（PE公司）；PE200系列泵，ISS200自動進樣器，PE101柱爐。

（1）可發酵糖色譜柱：預柱PE PEEK-C18 4.6 mm×10，分析柱Hypersil 5 μm NH2 4.6 mm×250；柱溫：30℃；示差折光檢測器；流動相：重蒸水，流速1 ml/min，進樣量均為10 μl。

（2）有機酸色譜柱：預柱PE PEEK-C18 4.6 mm×10，分析柱Nucleosil 5 μm C18 4.6 mm×250；柱溫：18℃；二極管陣列檢測器檢測波長215 nm；流動相：0.1 mol/L磷酸氫二鉀，流速0.8 ml/min，進樣量均為50 μl。

1.3樣品前處理

測試樣品需在室溫20±0.5℃平衡后取樣，啤酒和發酵液樣品紙濾后再膜濾，取入樣品瓶后直接進樣；麥汁殺菌后離心取上清液依濃度而稀釋，先紙濾后再膜濾，取入樣品瓶直接進樣。

1.4定性定量方法

（1）可發酵糖以保留時間（Rt）和標樣添加定性，外標法和內標法定量。

（2）有機酸以保留時間、標樣添加和各有機酸紫外吸收光譜來定性，外標法定量。

二、結果與討論

2.1可發酵糖測定方法

（1）方法的線性關系和最小檢測限 配制一定濃度的果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、麥芽三糖，進樣體積1 μl～100 μl，進樣量C微克（μg）與峰面積（A）之間建立回歸方程：以上各種糖的線性范圍、回歸方程及相關系數r分別為：果糖5～100 μg，C=0.6631+7.642×10－6A，r=0.9999；葡萄糖50～100 μg，C=2.8024＋6.601×10－5A，r=0.9992；蔗糖5～50 μg，C＝0．1274＋8．173×10－6A，r=0.9995；麥芽糖32～320 μg，C＝4．4336＋8.402×10－6A，r=0.9997；麥芽三糖6～120 μg，C=2.3689+8.763×10－6A，r=0.9993，最低檢出限量分別為0.2685 μg、0.1844 μg、0.2261 μg、0.3585 μg、0.427 μg。

（2）方法的精密度（內標計算） 以木糖為內標，配制一定濃度的果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、麥芽三糖混合標樣，采用單點平均校正因子，同一樣品重復進樣6次，計算平標準偏差和相對標準偏差，結果為：標準偏差＜0.03；相對標準偏差＜0.4%。

（3）方法的回收率對已知含量的樣品添加一定量的果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、麥芽三糖，計算回收率，結果為：97.2%～99．9%。

（4）分析樣品時內標法與外標法測定結果的比較同一樣品內標法和外標法測定結果的比較，說明測定三糖以內的糖類，二種定量方法均可采用。

（5）結論采用Hypersil NH2柱，以重蒸水和乙腈作流動相，以保留時間和標樣添加法定性，外標法和內標法定量，測定麥汁、發酵液和啤酒中的果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖及麥芽三糖，此法已用于實際樣品的測定。

2.2有機酸的測定方法

（1）定性方法啤酒中各有機酸保留時間的相對標準偏差＜1.4%；加入純標樣于啤酒中；對照峰高，如試樣某一組分的峰高增加，表示試樣中可能含有所加入的組分；啤酒中各有機酸紫外吸收光譜：草酸、酒石酸、丙酮酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸和延胡索酸在210～215 nm處均有吸收，草酸、丙酮酸和延胡索酸在254 nm處亦有吸收，其它有機酸254 nm處無吸收。

（2）定量方法的精密度和回收率取有機酸混合標樣，采用單點平均校正因子，混合有機酸標樣重復進樣5次，采用平均校正因子，定量測定啤酒和加標啤酒樣品，取5次測定值（g/100 L），計算相對標準偏差及回收率

結果為：各有機酸的相對標準偏差＜2.3%，回收率89.4%～107.8%。可見采用Nucleosil C18柱，二極管陣列檢測器，以磷酸二氫鉀為流動相，等速洗脫，以保留時間和標樣添加及各有機酸的紫外吸收光譜定性，采用平均校正因子外標法定量，此方法適于分析啤酒、發酵液和麥汁中的草酸、酒石酸、丙酮酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸等有機酸。