高效液相色譜如何工作？

一個儲液瓶裝有溶劑[稱為流動相，因為溶劑是流動的]。一個高壓泵[溶劑傳輸系統或稱溶劑管理器]用來產生和計量流動相的流速，一般是毫升/分鐘。一個進樣器[樣品管理器或自動進樣器]可以將樣品導入[注射]連續的流動相，并由流動相攜帶樣品進入高效液相色譜柱。色譜柱裝有能獲得分離效果的填料。這種填料稱為固定相因為它被柱硬件包圍住。檢測器用來查看化合物流出色譜柱時被分開的譜帶[大多數化合物沒有顏色，所以人眼觀察不到]。流動相流出檢測器可被送至廢液瓶，或按需被收集。當流動相含有一個分開的化合物譜帶，高效液相色譜可以收集含有純化的化合物的該洗脫組分，用于進一步分析。這種方法稱為制備液相[在高效液相色譜量級中討論]。注意高壓管路和附件用來連接泵、進樣器、色譜柱和檢測器單元，形成流動相、樣品和化合物分離譜帶的通路。

　　高效液相色譜系統的各組成部分

檢測器連接計算機數據站，高效液相色譜系統單元先記錄電信號，再將電信號轉換為色譜圖，在顯示屏上展現出來。定性和定量樣品內溶物濃度(如圖F)。由于樣品中化合物性質差異很大，幾種類型的檢測器被開發出來。例如，如果一個化合物能吸收紫外光，可使用紫外吸收檢測器。如果這個化合物發熒光，可使用熒光檢測器。如果該化合物沒有上述性質之一，可使用更廣泛的檢測器，如蒸發光散射檢測器[ELSD]。最強大的方式是順序使用多個檢測器。例如，紫外和/或蒸發光檢測器可和質譜儀[MS]聯用來分析色譜分離的組分。這樣，從一次進樣，可得到分析物的更多綜合的信息。將質譜與高效液相色譜系統耦合稱之為液質用.

高效液相色譜操作

一個簡單的方法來理解如何獲得樣品中化合物的分離，如圖G中簡圖所示。流動相從左側進入色譜柱，流過顆粒層，再從右側流出。綠色箭頭代表流動方向。首先，上圖表示在零時的色譜柱[進樣時]，當樣品進入色譜柱并開始形成一個譜帶。這里顯示的樣品，是黃色、紅色和藍色染料的混合物，在進樣口形成一條單一的黑色樣品帶。

[現實中，這個樣品可以是任何能夠溶解在溶劑中的物質；一般來說化合物是沒有顏色的，色譜柱壁也不透明，所以我們需要一個檢測器來查看洗脫出來的分離組分。]

幾分鐘后[下圖],流動相連續并穩定通過填料層，我們可以看到不同的染料已經以不同的速度在分離開的譜帶中移動。這是因為在流動相和固定相之間存在對每種染料或分析物的吸附競爭。留意黃色染料譜帶移動最快，即將流出色譜柱。黃色染料比其他染料更喜歡[被吸附于]流動相。因此，它的流動速度較快，更為接近流動相的速度。藍色染料譜帶喜歡填料而不是流動相。它與填料顆粒有較強的吸附力使得它移動明顯更慢。換句話說，它是這個混合樣品中最強被保留的化合物。紅色染料譜帶對流動相吸引力一般，因此在色譜柱中的移動速度中等。由于每一種染料譜帶移動速度不同，我們能夠進行色譜分離。

　　Figure G: Understanding How a Chromatographic Column Works - Bands

什么是檢測器?

當分開的染料譜帶離開色譜柱后，它們馬上進入檢測器。檢測器帶有可以在流動相背景下看[檢測]到每個分開的化合物譜帶的流通池[如圖H]。[實際上，在通常的高效液相色譜分析濃度下許多化合物的溶液都是無色的。]一個合適的檢測器有能力辨別化合物的存在，并發送相應的信號到計算機數據站。正如前面談到的，根據所需分離和分析的化合物的特性和濃度，可以在眾多的檢測器中選擇其一。

什么是色譜圖?

色譜圖表示發生在高效液相色譜系統中的化學[色譜]分離。一系列從基線出現的峰以時間為坐標。每個峰代表對不同化合物的檢測器反應。色譜圖由計算機數據站描繪。[如圖H].

　　Figure H: How Peaks Are Created

圖H中，黃色譜帶完全通過了檢測器流通池；產生的電信號被送到計算機數據站。得到的色譜圖逐漸出現在屏幕上。請注意從進樣開始，色譜圖就在屏幕底部形成直線。這條直線稱為基線，它代表隨時間變化，純流動相通過流通池。隨著黃色分析物譜帶穿過流通池，一個較強信號被傳送到計算機。這條曲線，開始是上升，之后下降，和樣品譜帶中的黃色染料的濃度成正比。這就形成了色譜峰。當黃色譜帶完全流出檢測器的流通池，信號強度回到基線水平，而流通池現在又一次，只有流動相。由于黃色譜帶流動最快，首先從色譜柱洗脫出來，所以這是第一個峰。之后，一個紅色譜帶到達流通池。從紅色譜帶進入流通池開始，信號從基線抬起來，代表紅色譜帶的色譜峰被劃出來。在本圖中，紅色譜帶還沒有完全通過流通池。圖中所示是如果我們此刻停止該過程，紅色譜帶和紅色色譜峰的樣子。由于紅色譜帶的大部分已經通過了流通池，色譜峰的大部分已經被劃出來，如實線所示。如果我們能再開始，紅色譜帶能完全通過流通池[虛線]。最強保留的藍色譜帶流速最低，在紅色譜帶之后流出。虛線表示如果我們連續完成，一個完整的色譜圖如何出現。有意思的是藍色峰的寬度將是最寬的，而藍色分析物譜帶的寬度在柱子上、是最窄的，而從柱中流出時變得最寬。這是因為它在色譜柱填料床中移動較慢，需要較多時間[和流動相體積]才被完全洗脫出來。由于流動相在一個固定的速度下移動，這意味著藍色譜帶展寬和變稀。由于檢測器的反應與譜帶的濃度成正比，因此藍色峰高較低，而寬度較大。