高效液相色譜柱的保護與再生（二）

色譜柱再生

　　對使用時間較長、柱效逐漸下降的色譜柱，可用下述方法進行快速再生，以除去微量不潔雜質在柱頭的聚積。

　　正相柱：用下述極性強且能互溶的有機溶劑來洗滌色譜柱，每種溶劑每次用30mL清洗，按庚烷、lv仿、乙酸乙酯、丙酮(氨基柱不用)、甲醇、5%甲醇水溶液次序沖洗(洗脫劑的極性依次遞增)，最后再用純甲醇通過柱將水分帶出，拆下柱置于氣相色譜儀柱箱中升溫至75℃，以除去水分。另應注意不能使用乙醇，它會使柱喪失柱效。

　　反相柱：用極性溶劑每種30mL，按以下順序清洗：5%甲醇水溶液、0.5mol/L H3PO4(或0.1mol/L EDTA鈉鹽)、5%甲醇水溶液、甲醇、甲醇-lv仿(1：1)混合液、甲醇、5%甲醇水溶液。最后保存在甲醇溶劑中。

　　當色譜柱的性能變得很差時，可采用下述兩種方法，作最后的補救。

　　一種方法是修補柱頭并同時更換不銹鋼燒結片。當取下燒結片發現柱頭塌陷或填料被雜質污染時，可挖掉0.5mm左右的固定相，再重新填充同樣的干燥固定相，用少量流動相潤濕，再填充干燥的固定相與柱口平齊(必要時用光滑的不銹鋼棒壓緊)，如此重復3～5次。

　　再換上新的不銹鋼燒結過濾片，擰緊結頭，與高壓泵連接，用流動相沖洗20min，若柱壓力降恢復正常，可連接檢測器，測柱效。若柱效恢復就可繼續使用。若柱壓力降恢復正常，但柱效仍偏低，表明柱頭未填充緊密，仍有空隙，此時應重復上述操作，直至柱壓力降恢復正常、柱效也恢復正常才可繼續使用。

　　另一種方法是倒沖色譜柱。此法適用于已修補過柱頭，柱壽命已達中后期的色譜柱。柱逆向使用后柱效會損失較大(約30%)，倒沖柱可檢查柱頭不銹鋼燒結片是否堵塞。若已堵塞在倒沖柱時，可觀察到柱壓力降減小，待柱壓力降恢復正常，再將色譜柱按原方向安裝使用。

　　柱的使用和維護注意事項

　　色譜柱的正確使用和維護十分重要，稍有不慎就會降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。

　　在色譜操作過程中，需要注意下列問題，以維護色譜柱。

　　1、避免壓力和溫度的急劇變化及任何機械震動。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會影響柱內的填充狀況;柱壓的突然升高或降低也會沖動柱內填料，因此在調節流速時應該緩慢進行，在閥進樣時閥的轉動不能過緩。

　　2、應逐漸改變溶劑的組成，特別是反相色譜中，不應直接從有機溶劑改變為全部是水，反之亦然，流動相使用前必須經脫氣和過濾處理。

　　3、一般說來色譜柱不能反沖，只有生產者指明該柱可以反沖時，才可以反沖除去留在柱頭的雜質。否則反沖會迅速降低柱效。

　　4、選擇使用適宜的流動相(尤其是pH)，以避免固定相被破壞。有時可以在進樣器前面連接一預柱，分析柱是鍵合硅膠時，預柱為硅膠，可使流動相在進入分析柱之前預先被硅膠“飽和”，避免分析柱中的硅膠基質被溶解，壓力升高是需要更換預柱的信號。

　　5、避免將基質復雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內，需要對樣品進行預處 理或者在進樣器和色譜柱之間連接一保護柱。保護柱一般是填有相似固定相的短柱。保護柱可以而且應該經常更換。

　　6、經常用強溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內的雜質。在進行清洗時，對流路系統中流動相的置換應以相混溶的溶劑逐漸過渡，每種流動相的體積應是柱體積的20倍左右，即常規分析需要50～75ml。

　　7、避免使用高粘度的溶劑作為流動相;如果使用極性或離子性的緩沖溶液作流動相，應在實驗完畢柱子沖洗干凈。

　　8、進樣樣品要提純;

　　9、嚴格控制進樣量，不要超載。

　　10、每天分析測定結束后，都要用適當的溶劑來清洗柱，應該用洗脫能力強的洗脫液沖洗，例如ODS柱宜用甲醇沖洗至基線平衡。當采用鹽緩沖溶液作流動相時，使用完后應用無鹽流動相沖洗。含鹵族元素(氟、氯、溴)的化合物可能會腐蝕不銹鋼管道，不宜長期與之接觸。裝在HPLC儀上柱子如不經常使用，應每隔4~5天開機沖洗15分鐘。

　　11、大多數反相色譜柱的pH穩定范圍是2-7.5，盡量不超過該色譜柱的pH范圍。

　　12、按說明書保存色譜柱，禁止講緩沖液留在柱內過夜，注意反相柱不能用純水長時間沖。

　　13、不建議拆開柱子，自己更換填料。