高效液相色譜柱的選擇

在高效液相色譜中，對色譜填料的要求十分嚴格，色譜填料的選擇將關系到分離效果的好壞，所以我們的難題就是，該如何選擇色譜填料呢？對此，杭州格圖科技教您如何選擇高效液相色譜柱。

    首先，要選擇合適的色譜填料，就必須對此有一定的認識和了解，因為色譜填料的選擇范圍太寬了，分別為聚合物填料、硅膠基質填料和其它無機填料。

    一、聚合物填料，聚合物填料多為聚苯乙烯—二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸脂等，其優點是在PH值為1—14均可使用。這類填料具有較強的疏水性，而且大孔的聚合物對蛋白質等樣品的分離非常有效。其缺點是相對硅膠基質填料，色譜柱柱效較低。

    二、硅膠基質填料

1、正相色譜，正相色譜用的固定相通常為硅膠以及其他具有極性官能團胺基團，如（NH2，APS）和氰基團的鍵合相填料。由于硅膠表面的硅羥基或其他極性 基團極性較強，因此，分離的次序是依據樣品中各組分的極性大小，即極性較弱的組份最先被沖洗出色譜柱。正相色譜使用的流動相極性相對比固定相低，如正已 烷，氯仿，二氯甲烷等。

2、反向色譜，反向色譜用的填料常是以硅膠為基質，表面鍵合有極性相對較弱官能團的鍵合相。反向色譜所使用的流動相極性較強，通常為水、緩沖液與甲醇、乙 腈等的混合物。樣品流出色譜柱的順序是極性較強的組分最先被沖洗出，而極性弱的組分會在色譜柱上有更強的保留。常用的反向填料有：C18（ODS）、 C8（MOS）、C4（Butyl）、C6H5（Phenyl）等。

    三、其它無機填料，其它HPLC的無機填料色譜柱也已經商品化由于其特殊的性質，一般僅限于特殊的用途。

    上面教了大家如何選擇色譜填料，其實光選好色譜填料是不夠的，我們還要選擇填料粒度，下面就教大家如何選擇填料粒度。

      如何選擇填料粒度？目前，高效液相色譜柱廠家色譜填料粒度從1um到超過30um均有銷售，而目前分析分離主要用3和5um填料進行。填料的粒度主要影響 填充柱的兩個參數，即柱效和背壓。粒度越小，柱壓越大，柱壓的增加限制了粒度小于3um的填料應用。在相同選擇性條件下，提高柱效可提高分離度，但不是唯 一的因素。如果固定相選擇是正確，但是分離度不夠，那么選用更小的粒度的填料是很有用的。3um填料填充柱的柱效比相同條件下的5um填料的柱效提高近 30%；然而，3um的色譜柱的背壓卻是5um的2倍。與此同時，柱效提高意味著在相同條件下可以選用更短的色譜柱，即相同的塔板數或分離能力，但是柱長 更短，以縮短分析時間。另外，可以采用低粘度的溶劑做流動相或增加色譜柱的使用溫度，比如用乙腈代替甲醇，以降低色譜柱的壓力。

    對于如何選擇高效液相色譜柱這個問題，一定要多了解色譜填料，只有了解它了，在高效液相色譜中，我們就能取得好的分離效果。

 二、液相色譜柱的使用
    色譜柱在使用前，最好進行柱的性能測試，并將結果保存起來，作為今后評價柱性能變化的參考。在做柱性能測試時要按照色譜柱出廠報告中的條件進行(出廠測試所使用的條件是最佳條件)，只有這樣，測得的結果才有可比性。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動相、柱溫等條件的差異而有所不同。 1、樣品的前處理
a、最好使用流動相溶解樣品。
b、使用預處理柱除去樣品中的強極性或與柱填料產生不可逆吸附的雜質。 c、使用0.45μm的過濾膜過濾除去微粒雜質。 2、流動相的配制
    液相色譜是樣品組分在柱填料與流動相之間質量交換而達到分離的目的，因此要求流動相具備以下的特點：
a、流動相對樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會沉淀在柱中(或長期留在柱中)。 b、流動相與樣品不產生化學反應
c、流動相的黏度要盡量小，以便得到好的分離效果；降低柱壓降，延長泵的使用壽命(可運用提高溫度的方法降低流動相的黏度)。
d、流動相的物化性質要與使用的檢測器相適應。如使用UV檢測器，最好使用對紫外吸收較低的溶劑配制。
e、流動相沸點不要太低，否則容易產生氣泡，導致實驗無法進行。 
f、在流動相配制好后，一定要進行脫氣。除去溶解在流動相中的微量氣體既有利于檢測，還可以防止流動相中的微量氧與樣品發生作用。