高效液相色譜法測定咖啡中的咖啡因含量

一、目的要求

1．理解反相色譜的原理和應用。

2．掌握標準曲線定量法。

二、原理

高效液相色譜的分離原理：見理論課教材

高效液相色譜的定性與定量：見理論課教材

高效液相色譜的儀器：見理論課教材

咖啡因又稱咖啡堿，屬黃嘌呤衍生物，化學名稱為1, 3, 7-三甲基黃嘌呤，可由茶葉或咖啡中提取而得的一種生物堿。它能興奮大腦皮層，使人精神興奮。咖啡中含咖啡因約為1.2%~1.8%，茶葉中約含2.0%~4.7%。可樂飲料、APC藥片等中含咖啡因。其分子式為C₈H₁₀O₂N₄，結構式為：

采用C-18柱反相液相色譜法進行分離，以紫外檢測器進行檢測，以咖啡因標準系列溶液外標法定量，可測定各類食品、藥品中咖啡因的含量。但實際樣品成分往往比較復雜，如果直接進樣，雖然操作簡單，但會影響色譜柱壽命。根據咖啡因的極性和酸堿性，采取萃取分離的方法進行前處理，可有效消除共存的干擾物，對提高定量準確度和保護色譜柱都有較大的益處。

三、儀器與試劑

儀器

試劑  1．甲醇（色譜純）；二次蒸餾水；氯仿(A.R.)；6 mol?L^-1鹽酸；飽和碳酸鈉溶液；咖啡因(A.R.)；咖啡豆（磨成粉狀）或速溶咖啡。

      2．1000 mg?L^-1咖啡因標準貯備溶液；將咖啡因在110℃下烘干1 h。準確稱取0.1000 g咖啡因，用氯仿溶解，定量轉移至100 mL容量瓶中，用氯仿稀釋至刻度。

四、實驗步驟

1．按操作說明書使色譜儀正常工作，色譜條件為：

柱溫：室溫；流動相：甲醇/水 = 60/40；流動相流量：1.0 mL?min^-1；檢測波長：275 nm

2．咖啡因標準系列溶液：濃度為10.0~100  mg?L^-1。

3．樣品處理：準確稱取0.25 g咖啡粉試樣，用30 mL蒸餾水煮沸10 min，冷卻后，將上層清夜轉移至100 mL容量瓶中，并按此步驟再重復二次，最后用蒸餾水定容至刻度。將上述樣品溶液分別進行干過濾（即用干漏斗、干濾紙過濾），收集25.0mL濾液。上述25.0 mL濾液全部轉移到125 mL分液漏斗中，，加入6mol/L鹽酸2mL，用10mL乙酸乙酯分兩次萃取，棄去乙酸乙酯層。水層中再加入飽和碳酸鈉溶液5mL，用20 mL乙酸乙酯分三次萃取。將酯層收集于25 mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度。

4．繪制工作曲線：待液相色譜儀基線平直后，分別注入咖啡因標準系列溶液10μL，記下峰面積和保留時間。

5．樣品測定：分別注入樣品溶液10μL，根據保留時間確定樣品中咖啡因色譜峰的位置，記下咖啡因色譜峰面積。

6．實驗結束后，按要求沖洗色譜系統，關好儀器。

五、結果處理

1．根據咖啡因標準系列溶液的色譜圖，繪制咖啡因峰面積與其濃度的關系曲線。

2．根據樣品中咖啡因色譜峰的峰面積，由工作曲線計咖啡中咖啡因含量（用mg?g^-1表示）。

六、注意事項

1．液相色譜法先經色譜柱分離后再檢測分析，可有效消除共存雜質的干擾。實際樣品成分往往比較復雜，如果不先萃取而直接進樣，雖然操作簡單，但會影響色譜柱壽命。

2．不同牌號的茶葉、咖啡中咖啡因含量不大相同，稱取的樣品量可酌情增減。

3．若樣品和標準溶液需保存，應置于冰箱中。

4. 為保護儀器色譜柱，柱壓不可超過25MPa，當柱壓達到20MPa時就應適當減小流速；

5. 進樣必須使用專用的平頭注射器，絕對嚴禁使用尖頭注射器；

6. 進樣前應排盡注射器中的氣泡，不可將氣泡注入色譜系統。

七、思考題

1．試樣處理時，兩次萃取的目的和原理有何不同？在操作上的要領有什么差異？

2．若標準曲線用咖啡因濃度對峰高作圖，能給出準確結果嗎？與本實驗的標準曲線相比何者優越？為什么？

3．在樣品過濾時，為什么要干過濾？干過濾時沒有收集全部濾液是否影響實驗結果？為什么？