高效液相色譜法測定肉食品中常見4種抗生素殘留

方案優勢     

快速，效率高，自動化，避免交叉感染，提高樣品分析精度。             

采用標準     

國家相關標準         

方法/原理/步驟

　　儀器與試劑

　　南京科捷：LC-10Tvp高壓恒流泵，SPD-10Tvp紫外檢測器

　　超聲波清洗儀       反相色譜柱C18

　　固相萃取柱      泰樂菌素、替米考星、氯霉素、氟苯尼考標準品均為天津市科密歐化學試劑開發中心監制

　　乙腈、正己烷均為優級純

　　其它試劑均為分析純

　　實驗用水均為二次蒸餾水

　　新鮮牛肉與雞肉均為超市所購

　　樣品處理

　　將新鮮牛肉及雞肉分別勻漿后，于-18℃冰箱中保存。測定時，將勻漿冷凍保存的牛肉與雞肉樣品于室溫下自然解凍。分別準確稱取20.0g樣品置于50mL具塞錐形瓶中，加入20mL乙腈，超聲10min，轉移至離心管，以5000r/min離心10min，收集上清液，離心沉淀物用上述方法重復提取2次，合并上清液。向得到的清夜中加入30mL正己烷，用力振蕩5min，靜置分層，棄去上層正己烷層。然后將溶液于40℃減壓旋轉蒸發至約2mL，氮氣吹干后加入5mL甲醇一磷酸鹽混合液超聲溶解抗生素，最好定容至10mL。樣品凈化

　　將HLB固相萃取小柱用5mL甲醇、5mL去離子水活化后，將4得到的樣品處理液上固相萃取柱(柱流速保持1滴/s)，用10mL蒸餾水、10mL5%甲醇水溶液淋洗固相萃取柱，再用10mL甲醇洗脫，將洗脫液用氮氣吹干后，加入流動相超聲定容至5mL，最后，經0.22um濾膜過濾后進樣。

        方法的準確度、精密度、線性范圍、回收率

　　對于牛肉樣品分別添加0.1、0.5、1.0mg/kg 3個水平的混合標準溶液，按照4與5樣品處理及凈化方法，每個水平平行測定4次，進行回收率實驗，并且以3倍信噪比分別計算泰樂菌素、替米考星、氯霉素、氟苯尼考在牛肉樣品中的檢出限，在測定條件下4種藥物在0.1—20mg/L范圍內均呈線性，線性方程與相關系數、平均回收率、相對標準偏差。

　　實際樣品檢測

　　本實驗分別對10份牛肉樣品和10份雞肉樣品中泰樂菌素、替米考星、氯霉素、氟苯尼考進行檢測，沒有發現牛肉樣品中含有以上抗生素，但是在4份雞肉樣品中都不同程度檢測到了泰樂菌素，最高為200ug/kg，最低為80ug/kg，平均含量為120ug/kg，高于我國動物性食品中獸藥最高殘留限量標準(100ug/kg)。

儀器設備

　　二、LC-10Tvp梯度高效液相色譜儀配置

　　LC-10Tvp高壓恒流泵：2臺

　　SPD-10Tvp紫外檢測器：1臺

　　SCL-10Tvp系統控制器：1臺

　　7725i手動進樣閥：1套

　　色譜工作站：1套 (VI2010、N2000、N3000選用)

　　液相色譜柱：1支 (C18 4.6*250mn,5um)

　　微量進樣器：1支 (50ul/100ul)

　　進樣支架 ：1只 (進樣閥用)

　　                                                  LC-10Tvp高壓恒流輸液泵

　　輸液方式                                        微體積串聯雙柱塞

　　最大輸液壓力                                      0～9999Psi

　　流量設定范圍                    0.001～9.999ml/min (以0.001ml/min步長調節流量)

　　流量設定值誤差                                            ≤0.5%

　　流量穩定性誤差                                     ≤0.2%RSD

　　壓力脈動                        小于15Psi (流量1mL/min，壓力600～1600Psi。)

　　泵密封性                       壓力為5400Psi，時間為10min，壓降小于400Psi。

　　時間程序功能                                                    有

　　尺寸                                                W260×H130×D420mm

　　重量                                                                 11kg

　　使用環境溫度范圍                                         4～40℃

　　                                          SPD-10Tvp紫外可見可變波長檢測器

　　波長范圍                                                   190nm～700nm

　　波長示值誤差                                                   ≤±1nm

　　波長重復性誤差                                               ≤±0.1nm

　　動態噪聲                                 ≤±0.75×10-5AU (甲醇，1ml/min，254nm，20℃。)

　　靜態噪音                                      ≤±0.5×10-5AU (空池，響應時間1秒，20℃。)

　　動態基線漂移                             ≤±1×10-4AU/h (甲醇，1ml/min，254nm，20℃。)

　　靜態基線漂移                               ≤0.5×10-4 (空池，響應時間1秒，20℃。)

　　線性范圍                                                                ≥104

　　最小檢測濃度                                     ≤1×10-9g/mL (萘/甲醇溶液)

　　定性重復性                                                   RSD6≤0.1%

　　定量重復性                                                    RSD6≤0.5%

　　光譜帶寬                                                                 6nm

　　流通池體積                                                               8μL

　　光程                                                                       10mm

　　時間程序功能                                                              有

　　尺寸                                                           W260×H130×D420mm

　　重量                                                                         11kg

　　使用環境溫度范圍                                                 4～40℃

　　色譜條件

        C18反相色譜柱

　　柱溫25℃，流速1mL/min，進樣量25uL，梯度洗脫條件A相為甲醇，B相為0.2mol/L磷酸二氫鈉含10%(體積比)甲醇，調節pH為3.0，梯度洗脫程序：0-2min10%A，2-8min 10%-40%A，8-9min40%-10%A，檢測波長入為275nm

　　標準溶液的配制及標準曲線的制備

　　分別準確稱取各標準品0.01g(精確至0.001g)，用甲醇分別溶解并定容至100mL，配制成100mg/L標準儲備液，于一4℃冰箱中冷藏，測定時將各標準溶液混合后稀釋成0.1、0.2、0.5、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0mg/L的溶液。分別以泰樂菌素、替米考星、氯霉素、氟苯尼考峰面積為縱坐標，質量濃度為橫坐標繪制標準曲線，計算回歸方程及相關系數(r)。

結論

　　我國動物性食品中獸藥最高殘留限量標準規定泰樂菌素、替米考星、氯霉素、氟苯尼考在肉品中的最高殘留量(MRL)分別為100、75、1.5、200ug/kg，本實驗所測泰樂菌素、替米考星、氟苯尼考的檢出限分別為20、32、16ug/kg均在最高殘留限量以下，符合殘留檢測分析要求。由于氯霉素藥物特殊性，歐盟對氯霉素的檢出限要求為0.1ug/kg，美國FDA對氯霉素的檢出限要求為0.3ug/kg，按照本實驗方法，氯霉素檢出限為19ug/kg，還未達到國際上的要求，這是因為提取方法和所用檢測器所致。今后應該發展更加靈敏的方法以提高氯霉素。本實驗方法的平均回收率較高(75%-87%)，而且步驟簡單、操作容易、重現性較好相對標準偏差為1.35%-5.41%，表明方法穩定可靠。