1)原理
試樣中的維生素A及維生素E經皂化處理后,將其從不可皂化部分提取至有機溶劑中。用高效液相色譜反相柱(RP-C18),將維生素A和維生素E分離,經紫外檢測器檢測,并用內標法定量測定。
2)儀器
①高效液相色譜儀(帶紫外檢測器)。
②旋轉蒸發器。
③高速離心機。
④小離心管:具塑料蓋,1.5～30mL塑料離心管(與高速離心機配套)。
⑤高純氮氣。
⑥恒溫水浴鍋。
⑦紫外檢測器。
3)試劑
①無水乙醚:不含有過氧化物。
a. 過氧化物的檢查方法 用2mL乙醚,加1mL10%碘化鉀溶液,振搖1min,如有過氧化物則放出游離碘,水層呈黃色或加4滴0.5%淀粉溶液,水層呈藍色。該乙醚需處理后使用。
b. 去除過氧化物的方法 重蒸餾乙醚時,瓶中放入純鐵絲或鐵末少許,棄去10%初液和10%殘餾液。
②無水乙醇:不得含有醛類物質。
a. 檢査方法 取2mL銀氨溶液于試管中,加入少量乙醇,搖勻,再加入氫氧化鈉溶液,加熱,放置冷卻后,若有銀鏡反應則表示乙醇中有醛。
b. 脫醛方法 取2g硝酸銀溶手少量水中,取4g氫氧化鈉溶于溫乙醇中,將兩者傾入1L乙醇中,振搖后,放置暗處2d(不時搖動,促進反應),經過濾,置蒸餾瓶中蒸餾,棄去初蒸出的50mL。當乙醇中含醛較多時,硝酸銀用量適當增加。
③無水硫酸鈉。
④甲醇:重蒸后使用。
⑤重蒸水:水中加少量高錳酸鉀,臨用前蒸餾。
⑥抗壞血酸溶液(100g/L):臨用前配制。
⑦氫氧化鉀溶液(1+1)。
⑧氫氧化鈉溶液(100g/L)。
⑨硝酸銀溶液(50g/L)。
⑩銀氨溶液 加氨水至硝酸銀溶液(50g/L)中,直至生成的沉淀重新溶解為止,再加氫氧化鈉溶液(100g/L)數滴,如發生沉淀,再加氨水直至溶解。
?維生素A標準溶液 視黃醇(純度85%)或視黃醇乙酸酯(純度95%)經皂化處理后使用。用脫醛乙醇溶解維生素A標準品,使其濃度大約為1mL相當于1mg視黃醇。臨用前用紫外分光光度法標定其準確濃度。
?維生素E標準溶液 α-生育酚(純度95%)、γ-生育酚(純度95%)、δ-生育酚(純度95%)。用脫醛乙醇分別溶解以上三種維生素E標準品,使其濃度大約為1mL相當于1mg三種生育酚。臨用前用紫外分光光度計分別標定此三種生育酚溶液的準確濃度。
?內標溶液 稱取苯并[e]芘(純度98%),用脫醛乙醇配制成每1mL相當10μg苯并[e]芘的內標溶液。
4)操作方法
(1)試樣處理
①皂化 準確稱取1～10g試樣(含維生素A約3μg,維生素E各異構體約為40μg)于皂化瓶中,加30mL無水乙醇,進行攪拌,直到顆粒物分散均勻為止。加入5mL10%抗壞血酸、苯并[e]芘標準液2.00mL,混勻,加10mL氫氧化鉀溶液(1+1),混勻。于沸水浴回流30min,使皂化完全。皂化后立即放入冰水中冷卻。
②提取 將皂化后的試樣移入分液漏斗中,用50mL水分2～3次洗皂化瓶,洗液并入分液漏斗中,用約100mL乙醚分兩次洗皂化瓶及其殘渣,乙醚液并入分液漏斗中。如有殘渣,可將此液通過有脫脂棉的漏斗濾入分液漏斗中。輕輕搖動分液漏斗2min,靜置分層,棄去水層。
③洗滌 用約50mL水洗分液漏斗中的乙醚層,用pH試紙檢驗直至水層不顯堿性(最初水洗輕搖,逐次振搖強度可增加)。
④濃縮 將乙醚提取液經過無水硫酸鈉(約5g)濾人與旋轉蒸發器配套的250～300mL球形蒸發瓶內,用約100mL乙醚沖洗分液漏斗及無水硫酸鈉3次,并入蒸發瓶內,并將其接至旋轉蒸發器上,于55℃水浴中減壓并回收乙醚,待瓶中剩下2mL乙醚時,取下蒸發瓶,立即用氮氣吹掉乙醚,立即加入2.00mL乙醇,充分混合,溶解提取物。
將乙醇液移入一小塑料離心管中離心5min(5000r/min)。上清液供色譜分析。如果試樣中維生素含量過少,可用氮氣將乙醇液吹干后,再用乙醇重新定容,并記下體積比。
(2)標準曲線的繪制
①維生素A和維生素E標準濃度的標定 取維生素A和各維生素E標準液若干微升,分別稀釋至3.00mL乙醇中,并分別按給定波長測定各維生素的吸光值。用吸光系數計算出該維生素的濃度。測定條件如表1所示。
濃度按下列公式計算:
式中 c1——維生素的濃度,g/mL;
A——維生素平均紫外吸光值;
V——加入標準液的量,μL;
E——某種維生素1%吸光系數;
——標準液稀釋倍數。
②標準曲線的繪制 采用內標法定量。把一定量的維生素A、α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚及內標苯并[e]芘溶液混合均勻。選擇合適靈敏度,使上述物質的各峰高約為滿量程70%,為高濃度點。高濃度的1/2為低濃度點(其內標苯并[e]芘的濃度值不變),用此種濃度的混合標準進行色譜分析,得出色譜圖。維生素標準曲線繪制是以維生素峰面積與內標峰面積之比為縱坐標,維生素濃度為橫坐標繪制,或計算回歸方程。如有微處理機裝置,則按儀器說明用兩點內標法進行定量。
不能將β-生育酚和γ-生育酚分開,所以γ-生育酚峰中包含有β-生育酚峰。
(3)高效液相色譜分析
色譜條件(參考條件)如下。
①預柱:ultrasphere ODS10μm,4mm×4.5cm。
②分析柱:ultrasphere ODS5μm,4.6mm×25cm。
③流動相:甲醇+水=98+2,混勻,臨用前脫氣。
④紫外檢測器波長:300nm,量程0.02。
⑤進樣量:20μL。
⑥流速:1.7mL/min。
(4)試樣分析
取試樣濃縮液20μL,待繪制出色譜圖及色譜參數后,再進行定性和定量。
①定性:用標準物色譜峰的保留時間定性。
②定量:根據色譜圖求出某種維生素峰面積與內標物峰面積的比值,以此值在標準曲線上查到其含量,或用回歸方程求出其含量。
5)計算
式中 X——維生素的含量,mg/100g;
c——由標準曲線上查到某種維生素含量,μg/mL;
V——試樣濃縮定容體積,mL;
m——試樣質量,g。
計算結果表示到三位有效數字。
6)說明及注意事項
本方法為GB/T5009.82—2003標準第一法。本方法檢出限分別為:維生素A:0.8ng;α-生育酚:91.8ng;γ-生育酚:36.6ng;δ-生育酚20.6ng。