高效液相色譜法測定金銀花提取物中綠原酸

金銀花FlosLonicerae又名忍冬、雙花，為臨床常用中藥，具有清熱解毒、涼散風熱之功效，主治癰腫疔瘡、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風熱感冒、溫病發熱等。在中成藥中，金銀花或以細粉直接入藥，或以提取物的形式入藥，但大部分制劑以后者的形式入藥。

目的建立金銀花提取物中綠原酸含量的HPLC測定方法。方法國產C18柱（4.6mm×250mm，7μm）；流動相為乙腈：0.4%磷酸（12∶88）；檢測波長為327nm；流速1ml·min-1；進樣量10μl；柱溫25℃。結果綠原酸在0.0716～0.6444μg范圍內線性關系良好，r=0.9996；平均回收率99.99%，RSD=1.61%（n=6）。結論該方法簡便、快速、準確，可用于金銀花提取物的含量測定及質量控制。

金銀花入藥有兩種形式，一是以全草直接投料，煎煮入藥，即以煎煮液（即藥材的提取液）作為半成品（中間體）；另一種是先提取有效部位，而后以提取物投料，即以提取物作為中間體（原料）（劉艷娥《第二軍醫大學碩士學位論文》）。為了有效控制金銀花提取物（中間體）的內在質量，本實驗參考了有關文獻［2，3］及2005版《中國藥典》［4］方法，采用高效液相色譜法測定金銀花提取物中綠原酸含量。

1儀器與試藥Agilent1100series高效液相色譜儀（G1322A排氣閥，G1311A泵，G1316A柱溫箱，G1314A紫外檢測器），chemistation色譜工作站，KromasilC18色譜柱，超聲提取器（KQ3200DE型數控超聲儀昆山市超聲儀器有限公司）；綠原酸對照品（中國藥品生物制品鑒定所，批號110753-200212），金銀花提取物（本實驗室自制），乙腈，磷酸均為分析純；水為雙蒸水。

2方法與結果［5］2.1分析方法的建立——分離及檢測條件的選擇2.1.1色譜條件色譜柱為國產KromasilC18柱（250mm×4.6mm，7μm）；柱溫25℃；流動相為乙腈-0.4%磷酸（12∶88）；流速為1ml·min-1；檢測波長327nm。

2.1.2pH值對峰形的影響綠原酸屬于有機酸類物質，在HPLC測定時易發生前沿或拖尾峰，流動相加入酸可以改善這種現象。本實驗比較了水、乙酸、磷酸對峰形的影響，當選用0.4%磷酸時，可得到較好的色譜峰形。

2.1.3色譜系統適應性實驗在選定條件下，綠原酸和樣品中其他組分可基線分離，綠原酸與其相鄰色譜峰的分離度大于1.5，理論塔板數（N）為5000以上。

a-對照品b-供試品2.2對照品溶液的制備精密稱取綠原酸對照品適量，置棕色量瓶中，加50%甲醇制成每毫升含35.8μg的溶液，即得。2.3供試品溶液的制備精密稱取本提取物10mg，置100ml容量瓶中，雙蒸水溶解，超聲2min后，再用雙蒸水定容至刻度，搖勻，過0.45μg微孔濾膜，取續濾液即得。

2.4線性范圍的考察及其標準曲線的繪制精密吸取對照品溶液2，4，6，10，14，18μl，分別注入液相色譜儀。按上述色譜條件測定峰面積。以峰面積積分值（A）對進樣量進行回歸，得回歸曲線方程：Y=2468.4X-16.205，r=0.9996。結果表明，綠原酸在0.0716～0.6444μg范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.5精密度實驗精密吸取對照品溶液10μl，按上述色譜條件重復進樣6次，記錄各組綠原酸峰面積值，結果平均峰面積為：840.5，RSD為0.69%（n=6）。

2.6穩定性實驗取同一供試品溶液，分別于0，2，4，6，8h進樣10μl，測得綠原酸的平均峰面積值為：680.24，RSD為：0.38%（n=5），表明供試品溶液在8h內穩定。

2.7重復性實驗取同一批號（070204）樣品6份，按含量測定方法測定，結果綠原酸平均含量為28.01%，RSD為1.07%（n=6）。

2.8加樣回收率實驗精密稱取已知含量的金銀花提取物6份，分別精密添加綠原酸對照品適量，按供試品溶液的方法制備，測定，計算回收率。

2.9樣品測定取3批樣品，按照上述方法制備供試品溶液，進樣10μl，依照已確定的色譜條件測定，按峰面積值用外標法計算樣品中綠原酸的含量。

3討論金銀花提取物以有機酸為有效成分，本實驗以綠原酸含量作為金銀花提取物的質量控制指標，同時測定了3批金銀花提取物中綠原酸的含量，通過計算，其含量均在20%以上。本文所建立的方法簡便、快捷，重復性及穩定性均較好，可在實際生產中用于該提取物的質量控制。本文所做的工作為開發金銀花的相關產品提供了質量監控方法。